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荧光素酶检测时的注意事项

 发布时间:2022-06-15 点击量:181

标签:荧光素 细胞转染 荧光强度   荧光检测 启动子 

  萤火虫可以在萤光素酶的存在下将萤光素转化为氧化萤光素以发光。利用荧光素酶的较常见的科学测定是报告基因测定,其中可以通过测量来自荧光素酶反应的光信号来跟踪转录激活或抑制。建议使用双荧光素酶系统,其中发生二次生物发光反应。第二个信号由另一个分子发出。最常见的是由也可以生物发光的海肾基因编码(一些质粒已经包含海肾和萤光素酶基因,例如 Promega 的 pmirGLO)。这允许您将荧光素酶表达标准化为对照并测量您的相对转染效率。


荧光素酶检测过程中的注意事项
1.信号问题:无信号或低信号。
    这可能归于转染问题。我会先检查你的质粒的质量。确保您具有转染质量的 DNA正常的小量制备柱通常会携带更多的内毒素和盐,这些内毒素和盐可能会抑制您的细胞转染或导致细胞死亡。
    有些细胞难以转染。建议对使用的每个细胞系,对 DNA 和转染试剂的量进行滴定实验。显然,作为您的标准化对照,使用的海肾质粒的量应始终保持不变。
2.DNA 量:通常您要评估对照质粒与实验质粒,由于添加了实验序列,这些质粒的大小可能不同。即使您将相同量的 DNA 转染到每个孔中,每个孔获得的 DNA 总量也可能不同,因为您转染的摩尔比不同。
例如:
来自 2000 bp 质粒的 1 µg DNA 是 0.76 pmoles DNA
来自 3000 bp 质粒的 1 µg DNA 是 0.51 pmoles DNA。
较大的质粒每克含有较少的 DNA 摩尔数!因此,您需要转染更大质粒的更多 DNA,才能转染与小质粒相同数量的 DNA。为了使转染的 DNA 量标准化,许多人使用“填充"DNA,例如 pUC19 质粒(在哺乳动物细胞中没有功能)。
例如,要测试不同数量的荧光素酶质粒但保持总 DNA 相同,您可以执行以下操作:

3.时间:您可能错过了可视化效果的窗口。细胞通常在转染后 24 – 48 小时进行检测,但这在很大程度上取决于细胞机器表达您感兴趣的基因所需的时间。可以以优化转染后孵育时间的时间过程来决定检测细胞的合适时间点。
4.信号太强:饱和度:虽然高的信号可能被视为阳性,但您还需要确保您处于检测和光度计的动态范围内,并且不会使信号饱和。如果您有较高的值,则您可能使用了过多的 DNA。
启动子强度:此外,您可能需要更改质粒。如果您使用非常强的启动子,例如 CMV 或 SV40,这也可能会使您的信号饱和。某些应用(例如,如果您正在测量 miRNA 阻断结合位点的能力)需要较弱的启动子,因为您所看到的效果可能比转录阻遏元件的效果非常轻微。

重复之间的差异:
同一实验的孔之间的差异表现在:
1.移液:孔获得的液体量的微小变化会极大地影响转染和荧光素酶测定的执行方式。荧光素酶检测对此较为敏感!建议为您的转染反应制作预混液(即使它只是用于重复的 3 个孔)。对于每个组合,您应该始终至少有 2 次重复,最好是 3 次。
2.酶标板:另一个问题可能是你的酶标板。来自相邻孔的背景发光会干扰您的实验。建议您在白壁或不透明板中进行荧光素酶检测。但是,您无法在白色孔板中看到您的细胞,因为它们是完全白色的!
3.实验之间的变异(生物变异)
    应该重复多次实验,以确保您测量的效果是可重复的,因此有可能与生物学相关。然而,我们注意到细胞进行转染的能力在很大程度上取决于它们的汇合度,尤其是贴壁细胞。转染依赖于细胞表面接触,过度融合的细胞可能转染效率较低。不要假设如果您接种相同数量的细胞,它们每次都会以相同的方式沉淀在板的底部!从而致使细胞结块。严重地影响您细胞的转染效率和荧光素酶的检测结果。