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单克隆抗体技术原理及培养条件

 更新时间:2022-06-20 点击量:1575

标签:单克隆抗体技术 生物反应器 

抗体是具有免疫活性的糖蛋白结构。当它们识别细菌、病毒或肿瘤细胞等异物时,它们能够识别或诱导中和免疫反应。免疫球蛋白由 淋巴细胞响应抗原的存在而产生和分泌。目前,单克隆抗体(mAb) 主要是从这些细胞的培养中产生的。其需求的培养条件如下:

培养基的要求

哺乳动物细胞的培养基必须含有复杂的成分,从氨基酸到微量元素。为了满足细胞对这些营养素的需求,培养基在其成分中使用血清,然而,由于缺陷朊病毒引起的疾病的出现,例如牛海绵状脑炎 (BSE),因此有很大的动机去除任何动物成分培养基成分,特别是如果培养基用于生物制药产品的工业生产。这导致了不含任何动物成分的培养基的出现,包括用于 CHO 和 NS0 的明确培养基,这是 mAb 生产中常用的两种细胞类型。由于开发合适的培养基成本较高好所以,许多公司喜欢开发自己的生产培养基来维持生产批次之间的成分,并为将要使用的特定细胞类型开发合适的培养基成分,并实现对生产的更大控制。除此之外,开发满足高纯度产品要求的下游工艺和验证最终产品质量的测试会提高基于单克隆抗体的药物的总体生产成本尽管开发培养基很复杂,但在这一领域已经取得了很大进展,允许在合适的条件下进行更大的细胞生长并增加细胞保存时间,以促进目标分子的生长和生产 


单克隆抗体技术

培养条件的要求

细胞生长条件可以直接影响感兴趣分子的细胞生长和生产水平。通常,用于 mAb 生产的哺乳动物细胞培养条件非常明确:37 °CpH 7.15 30–60% 的溶解 2 (OD) 水平。二氧化碳2监测水平以模拟 31 至 54 mmHg 之间的生理标准。然而,细胞条件的变化已显示出改变细胞代谢向细胞生长或分子产生的巨大潜力,这可用于增加 mAb 的产生。生物过程可以设计为分两个阶段进行。首先,优化细胞生长以达到一定的细胞密度。一旦达到这个密度,第二阶段就开始了,生物反应器的条件发生了变化,因此细胞继续以维持速率生长,并将新陈代谢引导向单克隆抗体的产生。一些 CHO 细胞株和杂交瘤细胞对温度和 pH 值的变化很敏感。当温度和 pH 值低于通常使用的值时,值分别在 30 到 35°C 和 6.7-7.0 之间,细胞生长代谢减少,比产量增加。生长代谢减少还有助于降低某些对细胞培养物有毒的代谢化合物的产生,从而提高细胞活力,从而花费更多时间产生感兴趣的分子。监测细胞培养生长阶段以控制培养变化的一个好方法是观察 DO 和 pCO水平,也可以对其进行调整,以最大限度地提高 mAb 等蛋白质的产量 

生产工艺

单克隆抗体生产工艺

用于 mAb 生产的细胞培养可以遵循三种不同类型的过程。其中简单的是批量生产,它由一个封闭系统组成,在该系统中,生物反应器被灭菌并用含有细胞生长和产品制造所需的所有营养物质的培养基制备,然后接种细胞。没有新鲜培养基的进料系统或用过的培养基的退出。随着过程的进行,营养浓度降低并产生废物代谢物,从而降低细胞活力。

在此过程之中过程由于反应器内的环境很快变得不利于细胞生长,同时废物浓度增加。初始营养浓度和代谢废物产生等培养因素直接决定了细胞在浴培养中可以达到的MAX浓度。通常,这种培养方式的MAX密度为 1-2 × 106细胞/mL,然后细胞活力迅速下降。生产过程持续 4-7 天,当生产力达到一定的关注浓度时。收集上清液并通过下游工艺回收产品。每批完成所需的时间还取决于生产动力学。如果生产依赖于生长(生产与细胞生长同时发生),则可以在细胞达到稳定期后立即停止批处理。

与分批相比,使用的第二种生产过程是连续发酵。有两种类型的连续生产:恒化器培养和灌注培养。关于恒化器培养,将新鲜培养基添加到生物反应器中,并以恒定流速将发酵培养基与细胞一起去除,以使培养体积保持不变。流速(稀释率)控制细胞生长,当这两个变量相等时,生物反应器达到平衡——细胞浓度、营养浓度和产品浓度保持恒定。在这种情况下,培养物可以保持平衡数月,达到 10-30 × 10 细胞/mL  

为了避免活细胞损失以及细胞代谢副产物的不断流出,许多制造厂开发了细胞回收系统,因此开发了灌注培养方法,将细胞保存在生物反应器内。连续发酵的缺点是使用大量昂贵的培养基和难以回收的产品,产品过度稀释。为了解决产品稀释问题,一些生产制造厂有超滤系统,将产品保留在生物反应器内 。此类过程的另一个障碍是,为稳定的工业生产工厂建立培养条件可能需要数月时间。为此,所使用的菌株必须非常稳定,并清楚地阐明其生理方面,例如生长速率、生产力和对某些压力条件的反应。在稳定的生产工厂落户之前,多次尝试的情况并不鲜见,但是一旦落户,这种生产过程可以带来许多优势,因为它可以在更小体积的生物反应器中运行,因此具有更大的生产灵活性。

第三种生产单克隆抗体的工艺是迄今为止工业规模使用较多的工艺,即分批补料工艺。在这个过程中,细胞密度达到 8-12 × 10 细胞/mL,并且通过在一定的时间间隔内控制营养添加来提高生物反应器中的细胞活力。生产过程可能需要 12-20 天。通常,初始培养中使用的相同培养基也用于饲喂,但浓度更高。可以设计补料溶液组合物,通过分析和识别消耗更多的培养基营养物,根据细胞在不同培养阶段的代谢状态来供应细胞。此外,可以修改用于喂养的培养基以促进细胞生长或刺激分子产生,因为不同的成分可能会改变细胞的行为,从而改变新陈代谢以达到不同的目的。进料溶液还可以设计为最大限度地减少过量代谢物的产生,这些代谢物会在过量时引起细胞应激。

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