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琼脂糖凝胶电泳实验的实验步骤及操作方法

 发布时间:2022-06-28 点击量:488
琼脂糖凝胶电泳是鉴定核酸、蛋白分子量的常用方法,通过琼脂糖凝胶电泳实验分析,可以有效地识别出核酸类型及DNA片段的大小。


实验前准备:
1、琼脂糖凝胶:琼脂糖凝胶的配置浓度需要根据DNA片段长度的大小而定。具体的琼脂糖凝胶的配置浓度参考范围如下:

 


2、缓冲液:核酸的电泳缓冲液主要有有 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE) 3种。实验中多选用TBE缓冲液,如果考虑成本因素的话也可以尝试使用TAE缓冲液。TPE缓冲液磷酸盐浓度较高,在进行DNA回收时容易形成沉淀。10XTBE缓冲液可以直接购买,也可以自行配制。
10XTBE缓冲液配制方法如下:
Tris:108克
EDTA: 9.3克
硼酸:55克
加纯水到1000ul (PH为8.0~8.2之间) ,使用时用20倍的水稀释到0.5XTBE即可。


3、指示剂的使用
指示剂:在DNA电泳实验中常用的指示剂主要为溴二甲苯酚蓝和二甲苯青等。碱性环境下的溴二甲苯酚蓝呈现紫蓝色,在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速率也不相同。比如:在0.6%浓度的凝胶中的迁移率与1KB长度的DNA片段基本一致。而在1%左右浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率与0.6KB长度的双链DNA片段基本一致。
二甲苯青溶于水呈现蓝色,同样在浓度不同的凝胶中二甲苯青的迁移速率也是不相同的,比如在1%琼脂糖凝胶电泳时,其迁移速率大致与2Kb双链DNA接近。

4、染色剂的使用
染色剂:核酸电泳后,需经染色后才能显现出带型,琼脂糖凝胶实验较为常用的是EB染色,也就是溴化乙锭染色法。根据实际实验情况,可在凝胶电泳缓冲液中加入浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭,或电泳后将凝胶置入浓度为0.5ug/ml EB溶液中染色10-15分钟。即可看到条带。值的注意的是EB浓度如果过高会影响到条带的清晰度。


5、核酸电泳设备
核酸电泳设备主要包括电泳仪、电泳槽、梳子等。

凝胶电泳.png

6.核酸电泳方法
(1)在用纯水清洗过的电泳槽里放置好梳子。
(2)将稀释好的0.5xTBE缓冲液加入三角瓶中,并加入定量的琼脂粉,根据实验要求配置好对应的琼脂糖凝胶。待冷却到60°C时即可加入EB。缓慢倒入电泳槽中凝固。
(3)待胶凝固后,箱电泳槽中缓缓加入0.5XBE浓度的TBE,加入量以淹没胶面2MM为宜。
(4)打开电源,进行电泳操作。
(5)根据电泳条带进行电泳分析比对。

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