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pcr扩增的原理和具体实验步骤

 发布时间:2022-07-26 点击量:685

pcr扩增的原理和具体实验步骤

PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一,在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。pcr扩增的原理和步骤如下:

一、试剂准备:
PCR常用的试剂主要包括 DNA 模板、引物、ddH 2 O、 DNA 聚合酶以及特定的反应缓冲液、dNTP、MgSO 4(可选)和 DMSO (可选)。 

二、PCR实验前的准备
在开始PCR实验之前,必须准备好DNA模板(基因组DNA 或逆转录制备的cDNA)、特异性引物(自己设计或用软件设计),并选择合适的商业酶(选择符合您实验目的的酶) 

1.DNA聚合酶。有许多商业 DNA 聚合酶,它们具有不同的特性。一般分为两类:高保真聚合酶和普通Taq 聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 DNA 片段进行 PCR,请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在,就选择普通的 Taq 聚合酶。如果要对T-vector连接的片段进行PCR,要注意 ,因为大多数高保真聚合酶的产物都没有 A-tailing,所以应该选择普通的Taq聚合酶或在PCR 实验后添加 A-tailing。

2.引物的特异性影响 PCR 成功的概率,良好的引物设计对 PCR 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时,应仔细考虑以下几个原则:
①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(Tm)。Tm 定义为在此温度下,DNA 双链体的一半将解离成单链 DNA。52-58C 范围内的引物 Tm 是*佳的。
③GC 含量。*佳 GC 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计,例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。

pcr实验步骤

三、 pcr实验步骤:
根据PCR使用说明进行试剂混合预配,并设置 PCR 循环。
简而言之,pcr扩增的原理和步骤需要经过以下 循环:
1.初始化步骤。这仅对热启动 PCR。此步骤将溶液加热至 94-98°C ,以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤。DNA是双链分子,DNA扩增需要引物与单链 DNA模板相互作用。在此步骤中,将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒,以破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。
3.退火步骤。变性后,反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补,当反应温度降低到 50-65℃时,引物会与模板序列匹配,互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm,一般比引物Tm 低 3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以完全退火,然后聚合酶将定位到引物- 模板杂交体以开始 DNA 组装。
4.伸长步骤。在此步骤中,DNA 聚合酶开始合成 DNA,因此温度应为 DNA 聚合酶的最适温度。一般选择 72°C,但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内 DNA复制非常相似,DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中,以 5' 到3'方向与模板互补,最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说,DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。
5. 循环。2~4步称为一个循环,每循环一次,目标片段量翻倍。一个 PCR 过程使用 30-35 个循环。在 PCR 循环的早期,PCR 产物以指数速率积累,而在 PCR 循环的后期,随着 dNTPs、引物的减少和 DNA 聚合酶在变性温度下的失活,反应减慢,PCR 速率逐渐下降。
6.终伸长率。30-35个循环结束后,在68-74℃的温度下终延伸约 5-10分钟,以充分延伸剩余的单链DNA。
7.贮存。产品可以在 PCR 机器中维持温度在 4-10°C。

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