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Wetern Blot蛋白印迹实验方法及步骤

 发布时间:2022-11-10 点击量:136
Wetern Blot蛋白印迹实验方法及步骤
蛋白免疫印迹法是蛋白质学中常用的检测方法,Wetern Blot-蛋白印迹实验步骤

主要是通过SDS凝胶分离、转印到膜上并进行信号检测的方法。具体实验方法如下:
一、试剂和缓冲液
  • l 1x RIPA 缓冲液:50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脱氧胆酸钠、 1% Triton X-100 或 NP40。

  • l 1x PBS 缓冲液:137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4

  • l BCA 蛋白检测试剂盒或 Bradford 蛋白检测试剂盒

  • l 1.5 M Tris 缓冲液 (pH 8.8): 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O,使用 HCl 将 pH 调节至 8.8,最后 500 ml

  • l 1.0 M Tris 缓冲液 (pH 6.8):60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O,使用 HCl 将 pH 调节至 6.8,最后 500 ml

  • l 10% APS:使用前制备的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。

  • l 10% SDS:10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。

  • l 1x Tris-甘氨酸缓冲液:Tris配比25 mM;  PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。

  • l 3x SDS 蛋白上样缓冲液配制:使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA浓度30 mM 和 溴酚蓝 配比0.2% 。缓冲液应随用随配、分装冷冻备用。1x TTBS : 25 mM Tris(pH 7.5):0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞

  • l 1x 转移缓冲液:3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇,添加 ddH 2 O 至 1L


二、样品制备
样品也可以在一些商业裂解缓冲液中裂解,例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解缓冲液 ,而不是 RIPA 缓冲液。

三、细胞培养样品制备
1. 贴壁细胞
  • l 去除上清液并用 1X PBS 洗涤以去除残留培养基。

  • l 添加预冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 缓冲液/100 mm 培养皿。在冰上孵育 5-10 分钟。

  • l 刮去细胞并转移到冰上预冷的 1.5 ml 微管中。

  • l (可选)均质化或超声处理。

  • l 4°C 12,000 rpm 离心 10-15 分钟,收集上清液备用。

  • l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。 

2. 上清细胞
  • l (可选)取出 100 ul 等分试样进行细胞计数。

  • l 将细胞转移到预冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 试管中,并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度离心 5 分钟。

  • l 取出培养基,用 1 ml 预冷的 1x PBS 重悬沉淀,然后转移到 1.5 ml 微管中。

  • l 在 4°C 下以 2000 rpm 离心 5 分钟。

  • l 用 1 ml 预冷 RIPA 缓冲液/10 7 个细胞重悬细胞沉淀

  • l 将细胞悬液在冰上摇晃 30 分钟。或均质化/超声处理。

  • l 4°C 12000 rpm 离心 10-15 分钟,收集上清液备用。

  • l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。

3.组织制备
  • l 组织制备和定量。把它们切成小块。

  • l 添加约 500-600 ul 预冷的 1x RIPA 缓冲液/100 mg 组织。

  • l 均匀组织。

  • l 在 4°C 下以 12000 rpm 离心 15-20 分钟。

  • l 收集上清液备用。

  • l 总蛋白应储存在 -20°C 直至需要。



 
分离凝胶浓度(%)蛋白质大小范围 (kDa)
825-200
1015-100
12.510-70
1512-45
204-40
 上图中:蛋白质分离范围由分辨凝胶浓度决定。Tricine-SDS-PAGE 可用于分离小于 30 kDa 的蛋白质的电泳系统 。

四、蛋白质定量
蛋白印迹实验步骤中的蛋白定量主要采用Bradford 法和 BCA 法。
1. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶制备:6%-15% 分离凝胶由顶部的浓缩凝胶 (5%) 和凝胶梳(10 或 15 个孔)制成。
溶解凝胶(10ml)浓缩凝胶(3ml)

6%8%10%12%15%
H 2 05.34.64.03.32.32.1
30% 丙烯酰胺混合物*2.02.73.34.05.00.5
1.5M Tris(pH 8.8)2.52.52.52.52.51.0M Tris (pH 6.8) 0.38
10% SDS0.10.10.10.10.10.03
10% APS0.10.10.1.10.10.03
TEMED0.0080.0060.0040.0040.0040.003
 五、上样和电泳
l 将 2X SDS 蛋白质上样缓冲液与蛋白质样品以 1:1 的比例混合。样品预热到 50-60°C。进行预染。

六、蛋白质转移
将蛋白质转移到 PVDF 或 NC 膜上进行抗体检测。
  • l 在 1X 转印缓冲液中预润湿凝胶、Whatman 纸和海绵等材料。

  • l PVDF 膜应在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分钟,然后移至 1X 转移缓冲液。

  • l 将以下材料堆叠:外壳(黑色面)、海绵、Whatman 纸、凝胶、膜、Whatman 纸、海绵、外壳(透明面)。

  • l 将黑色面朝黑色放入转印设备中。

  • l 在低温环境中,使用转印缓冲液进行转印操作。转印电流和时间可以根据实验过程和使用说明进行优化。


七、抗体孵育
  • l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推荐的稀释度稀释或根据结果优化稀释度。

  • l 在 4°C 下孵育过夜或更长时间,或在室温下孵育 4 小时。

  • l 回收一抗并储存在 4°C。然后在 RT 的振动筛上洗涤膜 3X 5-10 分钟。

  • l 在 1X TBST 中稀释二抗并将膜在室温下孵育 1 小时或在振荡器上在 4°C 下孵育 2-4 小时。

  • l 在 RT 的摇床上用 TBST 洗涤 3X 10 分钟。


ECL+ 系统和 X 射线胶片用于 HRP 标记的二抗。

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