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蛋白抗体生产过程中瞬时转染的优化方案

 发布时间:2022-11-17 点击量:134

随着药物靶点复杂性的增加,哺乳动物细胞系统中的基因重组蛋白质生产变得越来越普遍。通过瞬时转染的方式 适当的进行蛋白质折叠、组装和翻译后修饰对于哺乳动物细胞表达也具有重要的意义 。 

  源自 CHO 和 HEK 293 细胞的悬浮细胞系通常用于哺乳动物蛋白质生产。这些细胞系具有许多理想的特性,包括高表达水平、可扩展性(密度和体积)等等

部分基因药物使用稳定的转染剂,以实现批次间的一致性和大规模的低成本。过去十年中的细胞转染方面也有着许多进展,瞬时转染方法改进的细胞系、表达载体、培养基和递送方法哺乳动物蛋白表达等方面也被广泛使用

在许多药物发现应用中,使用瞬时转染方法快速筛选蛋白质构建体是有益的,因为它可以同时评估各种靶分子或蛋白质亚型。在多数情况下,瞬时转染是并行进行的,而更多资源密集型的稳定细胞系也正在开发中。

转染技术的使用稳定的转染试剂盒 可以提高悬浮 CHO 和 293 衍生细胞中的抗体蛋白滴度。比如:使用 Mirus Bio 的技术,通过添加质粒 DNA、Trans IT-PRO 转染试剂和 PRO Boost 试剂在无血清培养基中制备转染复合物。

 将复合物孵育 10-30 分钟后,可以将它们直接添加到正常生长培养基中的细胞中。使用快速转染试剂盒进行转染,无需在转染后更换培养基,适用于瞬时转染和稳定转染。对于分泌型抗体构建体,通常在分批发酵转染后 5-7 天获得Max滴度。

在优化瞬时转染方案期间应考虑以下几个参数,主要包括转染时的细胞密度、DNA 浓度、试剂与 DNA 的比率和细胞培养基。

1.细胞密度

在任何组织培养实验之前,细胞健康是一个重要的考虑因素。理想情况下,细胞应具有一致的倍增时间和高活力。细菌、酵母菌、病毒或支原体的污染不仅会损害细胞健康,还会降低转染效率。

对于可以生长到较高密度的悬浮细胞,在转染时优化细胞密度尤其重要。当细胞在转染过程中积极分裂时效率Max,这有助于质粒DNA 进入细胞核。 1显示了 CHO 悬浮细胞密度的滴定,范围为 0.25 x 10 6 –2.0 x 10 6 个细胞/mL。在转染时,在 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 个细胞/mL之间的细胞密度下检测到最大数量的 GFP 表达细胞(约 60%) 。

细胞密度图1
 1. 转染时的最佳细胞密度为 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 个细胞/mL。CHO-S 细胞在转染时使用Trans IT-PRO 转染试剂盒以一定范围的细胞密度转染。使用增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 报告质粒,使用 1:1:1 比例的反式 IT-PRO:Boost 试剂:DNA 形成复合物。使用流式细胞术在转染后 48 小时确定 GFP 转染效率。使用在 FreeStyle CHO 表达培养基(2 mL/孔)中培养的 FreeStyle™ CHO-S 细胞在 24 孔深孔摇床中进行转染。误差棒代表一式三份孔的标准偏差。

2.DNA浓度

在某些细胞类型中,增加质粒 DNA 浓度提升转染效率,提高基因表达。然而, DNA 的浓度如果过高,会使成本增加或者产生毒性。 2使用三种不同剂量的Trans IT-PRO 和 PRO Boost 试剂检查了每毫升培养物 0.25–3.0 µg 的一系列质粒 DNA 浓度。通常,每毫升培养物中 1.0–1.5 µg DNA ,是细胞表达的Max浓度。

转染试剂盒图2
 2. 使用Trans IT-PRO 转染试剂盒滴定 DNA 浓度和试剂与 DNA 的比率。在不同的质粒浓度 (0.25–3.0 µg/mL) 和使用三种不同比例的Trans IT-PRO:PRO Boost Reagent (0.5:0.5、1:1 和 2:2)/µg DNA 比较荧光素酶蛋白表达。使用在 BD Select CD1000 培养基(2 mL/孔)中培养的 FreeStyle CHO-S 细胞在 24 孔深孔摇床中进行转染。细胞以 0.5 x 10 6 个细胞/mL的密度铺板,转染后 48 小时收获,并使用常规荧光素酶测定法进行测定。误差棒代表一式三份孔的标准偏差。

2.试剂浓度

试剂与 DNA 的比率瞬时转染影响细胞转染速度的主要参数如果试剂量不足或过量会阻碍 DNA 递送。这是由于阳离子转染试剂和带负电的质粒 DNA 之间的静电相互作用促进了转染复合物的质膜结合和内化。然而,过多的正电荷通常与细胞毒性有关,因此需要滴定转染试剂与 DNA 的比率以确定峰值蛋白质表达。

 2比较了三种不同水平的Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent(每 µg DNA 0.5 µL–2.0 µL);使用浓度为每 1.0 µg DNA 各 1.0 µL 的Trans IT-PRO 和 PRO Boost 试剂可获得Max的荧光素酶表达。

3.培养基试剂配方

转染效率受培养生长培养基的影响,并且有许多市售的无血清生长培养基用于生物功能型蛋白质的生产。由于这些培养基配方是专有的,因此可能需要测试几种培养基配方以找到与所需转染方法互补的一种。

 3显示了悬浮 CHO 细胞,它们已适应五种不同的培养基配方。使用多种转染方法,包括: Trans IT-PRO 转染试剂盒、试剂 P 和试剂 F( 3 ,用编码人 IgG1 抗体构建体的质粒转染适应相应培养基的细胞。

在给定的转染方法中,分泌的抗体滴度变化超过 10 倍,具体取决于培养基类型。此外,并非所有转染技术都表现出广谱培养基兼容性。

悬浮 CHO 衍生细胞的瞬时转染效率直接关系到靶向药物的研发和生产。值得注意的是,蛋白质产量严重依赖于重组蛋白质的内在特性。相同亚型的两种抗体构建体可以产生截然不同的蛋白质滴度。比较两种或多种转染方法时,请在同一天使用相同的质粒 DNA 构建体和相同批次的细胞进行转染。这允许小化细胞和实验变量。

Trans IT-PRO 转染试剂盒等新转染方法使研究人员能够以直接一致的方式获得更高的蛋白质滴度。关键转染参数的进一步优化使研究人员能够获得高转染效率和足够的蛋白质产量,以加速药物发现。

蛋白质产量3


 3. 蛋白质产量取决于培养基配方和转染方法。FreeStyle CHO-S 细胞适应五种代表性生长培养基。使用Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent (1:1:1)、Reagent P (4:1) 或 Reagent F (1:1) 转染试剂转染细胞。在 24 孔深孔摇床块中进行转染,每毫升培养物中使用 1 µg DNA,转染时使用 0.5 x 10 6 个细胞/mL。从第 5 天澄清的上清液对人 IgG1 进行定量,并通过标准夹心 ELISA 进行分析。误差棒代表一式三份孔的

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