原生质体叶肉细胞瞬时表达方法

1、 生长培养好的试验材料（一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片）

2、 在拟南芥开花前取样（30片叶子左右即可）

3、 切取叶片为0.5-1mm的细条（如果材料能达到每克10⁷个原生质体， 10-20片叶子需要5-10mL酶解液）

4、 迅速将切下的样品转到酶解液中，要求全部浸没。

5、 黑暗条件下抽真空30min。

6、 连续酶解，室温下23℃黑暗中静止酶解3h

7、 利用光学显微镜检查原生质体（30-50μm大小）

8、 在过滤前加入等量的W5溶液

9、 洗干净滤网，并用W5润湿，之后过滤

10、 离心100g，1-2min沉淀原生质体，尽可能吸走上清，重复洗2 次

11、 重悬原生质体于W5中，保持在2*10⁵个 /ml，冰浴30min。

12、 100g离心2min，尽可能吸走上清，利用MMG重悬，浓度约 2*10⁵个/ml

13、 加入10μL质粒（1000ng-2000ng ）于2ml离心管中

14、 加入100μL原生质体（2*10⁴个），轻轻混匀。

15、 加110μL PEG solution，轻弹使充分混匀

16、 23℃室温孵育30min。

17、 加400-440μL W5混匀，终止反应

18、 100g，2min 23℃离心，去上清，重复洗一次

19、 用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养

20、 20-25℃孵育16h以上

21、 取样制片观察

溶液配制：

1、 酶解液的配制（20ml）

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