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原生质体叶肉细胞瞬时表达方法

 发布时间:2022-12-16 点击量:370


1、 生长培养好的试验材料(一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片)

2、 在拟南芥开花前取样(30片叶子左右即可)

3、 切取叶片为0.5-1mm的细条(如果材料能达到每克107个原生质体, 10-20片叶子需要5-10mL酶解液)

4、 迅速将切下的样品转到酶解液中,要求全部浸没。

5、 黑暗条件下抽真空30min

6、 连续酶解,室温下23℃黑暗中静止酶解3h

7、 利用光学显微镜检查原生质体(30-50μm大小)

8、 在过滤前加入等量的W5溶液

9、 洗干净滤网,并用W5润湿,之后过滤

10、 离心100g1-2min沉淀原生质体,尽可能吸走上清,重复洗2 

11、 重悬原生质体于W5中,保持在2*105 /ml,冰浴30min

12、 100g离心2min,尽可能吸走上清,利用MMG重悬,浓度约 2*105/ml

13、 加入10μL质粒(1000ng-2000ng )于2ml离心管中

14、 加入100μL原生质体(2*104个),轻轻混匀。

15、 110μL PEG solution,轻弹使充分混匀

16、 23℃室温孵育30min

17、 400-440μL W5混匀,终止反应

18、 100g2min 23℃离心,去上清,重复洗一次

19、 1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养

20、 20-25℃孵育16h以上

21、 取样制片观察


溶液配制:

1、 酶解液的配制(20ml


试剂终浓度质量/g
MES20mM0.08528KOH调pH5.7
D-Mannitol0.4M1.45736
KCl20mM0.02982
macerozyme R-100.40%0.08
Cellulase R-101.50%0.3
55℃水浴10min,待冷却后再加以下试剂
CaCl2·2H2O10mM0.029402
BSA0.10%0.02




W5溶液配制(500mL


试剂终浓度质量/g
MES2mM0.19524KOH调pH5.7
NaCl154mM4.49988
CaCl2·2H2O125mM9.18825
KCl5mM0.186375
MMG配制(100mL


试剂终浓度质量/g
MES4mM0.078096KOH调pH5.7
D-Mannitol0.4M7.2868
MgCl2·6H2O15mM0.30495
PEG配制(10mL


试剂终浓度质量/g
PEG 400040%4
D-Mannitol0.2M0.36434
CaCl2·2H2O100mM0.14701

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