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细胞外泌体来源和外泌体的表征方法

 发布时间:2023-01-10 点击量:127
细胞外泌体来源及表征方法
细胞外泌体是直径为 30-150 nm 的血管外囊泡亚群。在过去的20年里,科学家已经从包括正常细胞和癌细胞在内的许多细胞类型中分离出外泌体,并且研究了它们对其他细胞的影响。外泌体是由多种大分子组成,例如核酸、蛋白质和脂质。

细胞外泌体具有天然的特定细胞靶向特性,通常被设计用于靶向大分子(DNA 和 RNA)和药物递送系统(多柔比星、紫杉醇和紫杉醇)。目前常用细胞外泌体的分离方法主要是超速离心法、密度梯度离心法、超滤分离法、基于聚合物的沉淀法、亲和沉淀分离法、  免疫磁珠法和色谱法等

一、外泌体来源及其释放途径
外泌体在人体的主要作用是充当局部和全身信号和调节系统。外泌体(直径 30-150 nm)是较小的血管外囊泡亚群,它的还包括微泡(50 nm-1 μ m)和凋亡小体( 50 nm-5 μm)。

外泌体的来源是内体系统。由内膜出芽形成早期核内体,早期内体可以与内吞小泡融合,从而引导它们的货物进行回收、降解或分泌。当早期内体成熟为晚期内体时,在它们成熟为晚期核内体的过程中,囊泡膜向内出芽,导致多泡体 (MVB) 的产生,其中包含许多腔内囊泡 (ILV).  在此阶段,MVB 可以与溶酶体融合(ILV 继续降解)或与质膜融合,导致 ILV  释放到细胞外空间。这些释放的 ILV 称为外泌体,包含着许多源自细胞内部的蛋白质、核酸、脂质和多糖 。 另一种释放机制就是由于质膜向外出芽,从而导致形成所谓的脱落微泡或外泌体 。
 
图 1. 外泌体形成、释放和细胞内化的方案

二、 外泌体的表征方法
根据药物递送系统 (DDS) 表征外泌体结构至关重要,因为它决定了 DDS 的特性,例如细胞或组织亲和力、应激反应、吸收途径和药物释放。 2014  年和 2018 年国际细胞外囊泡学会 (MISEV2018) 提出了外泌体(包括研究和外泌体制备)应满足的基本要求指南。在开发基于外泌体的  DDS 时,必须考虑数量、大小、形态、膜组成和蛋白质(包括受体)等参数。这些参数表征所用的技术主要为光学、非光学和微流体技术。

1.光学方法
目前,光学方法是外泌体表征的主要方法,即动态光散射 (DLS)、多角度光散射 (MALS) 和纳米粒子跟踪分析 (NTA)  。这些方法允许对尺寸(DLS 0.5–200 nm;MALS 10 –500 nm;NTA 10–1000 nm )、尺寸分布和浓度进行高分辨率测量。 DLS 和 MALS 的结合增加了测量范围 (0.5–500 nm)  和精度。光学方法比较受欢迎的,但缺点是灵敏度低、试剂消耗高以及需要昂贵的设备。
在使用 纳米粒子跟踪分析NTA 方法过程中,荧光染料的加入也提高了分辨率,并允许通过使用荧光标记来表征表面免疫表型。从而确定标记物存在。

2.非光学方法
非光学方法主要包括扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、冷冻电子显微镜(Cryo-EM  )、原子力显微镜(AFM)、免疫检测方法(ELISA)、傅立叶变换红外光谱(FTIR  )、可调谐电阻脉冲传感 (TRPS) 和单粒子干涉反射成像传感器 (SP-  IRIS ) 。 SEM、TEM 和 AFM 方法通常用于直接膜结构和形态测定,而  ELISA 检测提供各种结构颗粒(主要是蛋白质和受体)的检测和量化,例如,用于外泌体形态的 确认。
   
FTIR 光谱和衰减全反射 FTIR (ATR-FTIR) 常用于外泌体质量量化和脂质和蛋白质含量的总体估计。使用 TRPS  ,可以同时测量大小、浓度和 zeta 电位。由于扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜的成本较高,近些年来,一种新型的纳米粒度分析仪器在外泌体研究领域迅速发展,比如 Nanocoulter粒度分析仪可以不仅可以进行 单颗粒检测,颗粒粒径检测还可以检测细胞外泌体的浓度、zeta电位、形态等进行多维度检测。

单粒子干涉反射成像传感器 (SP-IRIS) 也用于外泌体定量,但也可用于检测特定标记物和确定外泌体亚群. 

3.微流体分析技术
微流体技术在外泌体研究方面也起着推动作用。微流体技术不仅提供了高质量、高特异性的数据,并且试剂消耗量低,通量高. 

基于微流体技术的研究方法需要结合使用微流控芯片,微流控芯片通常由玻璃基和聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 膜制成,包含许多尺寸适合所分析样品的微通道。主要区别在于芯片的内表面,可以通过多种方式对其进行功能化,例如通过涂层、多层沉积、电沉积和  蚀刻. 目前研究中针对不同的微流控表征方法,也制造了不同类型的微芯片,包括免疫芯片、磁性芯片和电化学芯片。

外泌体及其蛋白质也可以通过比色法(标记抗体/ELISA)、直接荧光染色( DiO 染料)  、电化学 性质变化和光学方法进行检测。对于结果评估,还需要额外的设备,例如读板器或荧光显微镜等.

苏州阿尔法生物14年专注于生物实验室仪器和生物试剂 、实验室耗材的专业供应商。提供的粒度分析仪、荧光显微镜等广泛应用于细胞外泌体的研究。另外,提供的质粒提取试剂盒、PCR 试剂、一抗、双抗、二抗、抗体蛋白、单克隆抗体、基因组提取试剂盒、RNA提取试剂盒、Qpcr试剂、培养基、胎牛血清等生物试剂也广泛应用于生命科学实验。