药物传递系统DDS：是将脂质体、微囊、微球、微乳、纳米囊、纳米球、外泌体等作为药物载体将药物通过不同的给药方式，直接输送到病灶部位的一种新型医疗方式。
将药物加载到外泌体
在进行药物传递系统DDS设计时，其中一个重要的环节就是载药方法。由于外泌体具有生物相容性、稳定性和肿瘤靶向性，随着外泌体技术研究的不断发展 使它们成为有前景的药物载体。外泌体的构建类似于双膜脂质体，并且药物装载方法也类似。但在药物传递系统DDS设计前需要根据药物和外泌体特性仔细选择。
外泌体可以通过被动或主动方法装载多种药物、大分子和其他物质（ 图 3）。被动方法比较简单，它是基于药物与外泌体或细胞孵育，并进一步分离含有药物的释放外泌体（ 图 3 I、II）。这种方法通过不同的药物浓度梯度来实现；因此，在与外泌体孵育期间，物质本身也 会迁移到囊泡中。这一过程可以通过施加额外的力来加强，例如摇动或搅拌等.
被动装载法的缺点是装载效率低，输出药物浓度低（约 1%）。将药物与外泌体或其他 DDS 载体一起孵育是一种较常见并 且简单的方法，尤其适用于疏水性药物。
主动加载方法可以实现更高的加载效率，包括超声处理 (可达~28%)、电穿孔 (~5%) 、挤压、冻融、pH 梯度 (1.7%) 和结合方法。具体方法是通过超声处理和电穿孔在 外泌体膜上穿孔，再分别由声波或电脉冲介导（ 图 3 III、IV）。之后，外泌体将通过上述试剂诱导的小膜孔从溶液中加载药物。这些方法似乎不会改变外泌体膜的特性，但会导致外泌体大小增加。
主动加载法的另一种方法是通过抗体或点击化学将药物与外泌体结合。抗体将通过它们对外泌体结构元素的亲和力非共价结合到外泌体表面（ 图 3七). 化学合成将导致药物通过例如 PEG 或膜蛋白与外泌体共价结合，并且进一步释放取决于外泌体降解。这些方法还可以通过将特定受体引入膜来将外泌体靶向所需细胞 。
图 3. 将药物装入外泌体的方法。
( I )—从药物暴露细胞中释放的载药外泌体，
( II )— 药物与外泌体孵育并搅拌，
( III )—超声处理，
( IV )—电穿孔，
( V )— 挤出，
( VI )—冻融循环，
( VII )-药物与外泌体的化学缀合。
以上步骤中提到的方法允许根据药物的亲水性和亲脂性将药物掺入外泌体或磷脂双层的内部。亲水性物质将渗透于外泌体的腔内，而可溶于脂质的物质将聚集在外泌体的膜上（ 图2）。一些研究报告证明，亲水性物质很容易加载到外泌体中，而亲脂性物质的加载效率较低。通常，这些物质在体外 24 小时内从外泌体释放约 50% 。
选择药物加载方法时需要考虑到对外泌体结构和特性的影响。目前，通过电穿孔的聚集和融合法使用较为普遍。
实际上，外泌体作为细胞间信号传递分子可以递送多种物质，包括化疗药物（紫杉醇、多柔比星和紫杉醇）、RNA 和 DNA等 。另外，近年来还针对细菌（弓形虫病和沙门氏菌病）、病毒（艾滋病和乙型肝炎）、癌症（肺癌、胰腺癌、结肠癌、脑癌和乳腺癌）等进行基于外泌体的疫苗开发设计。所以外泌体也常被用作基因编辑工具递送的工具 ，例如 Cas9.
给药途径
根据目前的研究，外泌体主要通过静脉内给药，位置主要为肝脏肺和脑、胃中，只有少数研究使用另一种给药方法，即经鼻、口服和腹膜内给药。
表 4. 外泌体的药物、大分子和潜在靶向策略示例。
| 外泌体的药物方法和给药途径 |
| 药物/大分子 | 加载效率和方法 | 起源 | 靶向细胞/组织 | 影响 |
| 紫杉醇 | 1.4%；逆转录孵育；5.3%；电穿孔；28.3%；轻度超声处理 | RAW 264.7 细胞系 | Madin–Darby 犬肾 MDCK WT和 MDCK MDR1细胞，小鼠 Lewis 肺癌细胞亚系 (3LL-M27) | 多重耐药细胞系的细胞毒性增加超过 50 倍。 |
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| 阿霉素 | 7.4%；超声处理和随后的挤压 | 4T1细胞系 | MCF-7细胞系 | 近红外激光触发的多柔比星从用 Fe 3 O 4修饰的外泌体中释放。 |
| 阿霉素 | 6.5%；超声处理 | 雄性 KM 小鼠的小鼠骨髓 | 斑马鱼，携带 C6-Luc 神经胶质瘤的小鼠 | 快速血脑屏障穿越和脑积聚。靶向：浸润性脑肿瘤细胞。 |
| hsa-miR148a-3p | 无损检测；化学转染（Lipofectamine 2000） | 牛奶 | HepG2、Caco-2细胞系 | 具有成本效益的外泌体来源。时间依赖性细胞掺入。 |
| 紫杉醇 | 8%；逆转录孵育 | 牛奶 | 裸鼠肺肿瘤异种移植 | 肿瘤生长抑制。与静脉内给药相比，全身和免疫原性毒性较低 |
| 紫杉醇 | 14%；药物孵育细胞 | 来自脐带的 MSC | A549、SK-OV-3、MDA-hyb1细胞系；NODscid 小鼠的 MDA-hyb1 乳腺肿瘤 | 与含有紫杉醇的外泌体相比，使用高 1000 倍浓度的游离紫杉醇可减少癌症的生长和转移。 |
| 埃拉斯汀 | 3.2 毫克 erastin/毫克蛋白质；超声处理 | HFL-1细胞系 | MDA-MB-231细胞系 | 用于靶向递送、促进铁死亡、减少增殖和癌细胞迁移的叶酸标记外泌体。 |
| CRISPR/Cas9 质粒 DNA | 来自 MSC 的外泌体的化学转染（Exo-Fect™ 外泌体转染试剂盒）； |
| KPC689 | 成功破坏胰腺癌细胞中的Kras G12D致癌等位基因。抑制增殖和肿瘤生长 |
| CRISPR/Cas9 质粒 DNA | 细胞 (HEK293T) 的化学转染 (Lipofectamine 2000) 和从条件培养基中分离外泌体 | HEK293T细胞系 | 细胞系 |
| PEI 基质中靶向 KRAS 的 siRNA； | >90%；与 PEI 基质孵育； | 牛初乳 | H1299、A549、H522、Panc-1、MiaPaCa-2细胞系；体内 A549 异种移植模型 | 抑制肿瘤生长和 KRAS表达。在 p53-null H1299 细胞中诱导 p53 的表达。 |
| 编码 p53 的质粒 DNA | <5%；电穿孔； |
| 35% 用 Exo-Fect™ 进行化学转染（约 35%） |
| 阿霉素; 胆固醇修饰的 miRNA159 | 74.5–160.6 ng/μg 外泌体；在三乙胺溶液中孵育；1.2% 的 miRNA，5.3% 的胆固醇修饰的 miRNA | THP-1细胞系 | MDA-MB-231细胞系 | 外泌体的靶向特性，对癌细胞的协同治疗作用，抑制生长和运动。TCF-7 基因的沉默。 |
| 5-氟尿嘧啶；miR-21抑制剂寡核苷酸 | 3.1%；0.5%；电穿孔 | 293T细胞系 | HCT-116 SFR细胞系；体内 BALB/c 裸鼠 | 成功共递送、细胞中 miR-21 的下调、周期停滞的诱导、增殖减少、耐药性逆转、5-FU 细胞毒性增加、体内肿瘤生长减少 |
| miR-31-5p | 不适用；电穿孔 | 牛奶 | HUVEC细胞系；体内 BALB/c 小鼠 | 体外细胞功能改善，血管生成增强，糖尿病小鼠体内伤口愈合 |
| CD47 和 SIRPα 抗体 | 通过 pH 敏感接头与外泌体表面缀合 | RAW264.7细胞系 | RAW264.7细胞系，体内BALB/C小鼠 | 靶向 CD47 表达细胞，改善巨噬细胞吞噬作用，外泌体重编程巨噬细胞抗癌活性 |
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| galectin-9 siRNA，奥沙利铂 | 半乳糖凝集素9、13.17% 马来酰亚胺-硫醇偶联物的 13.17% N/A 电穿孔 | 骨髓间充质干细胞 | PANC-02细胞系，体内C57BL/6小鼠，SD大鼠 | 显着的抗癌活性，提高巨噬细胞肿瘤抑制活性，增加细胞毒性 T 淋巴细胞的募集 |
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| 小檗碱 | 17.13%，超声处理 | 原代巨噬细胞 | C57BL/6J小鼠 | 巨噬细胞抗炎和抗凋亡 M2 表型的诱导，脊髓损伤后小鼠运动的改善 |
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| Erastin、Rose Bengal、CD47 表面标记的外泌体 | 60%、84% 的包封率，超声处理；CD 47 质粒转染的供体细胞 | HEK293T细胞系 | RAW264.7 Hepa1-6 细胞系，体内 C57BL/6 | 阻止外泌体吞噬作用，激光照射后体内和体外铁死亡诱导，外泌体肝肾细胞毒性降低 |
| miR-138-5p | 慢病毒转染供体细胞 | 脂肪来源的干细胞 | T24，5637细胞系，体内BALB/C裸鼠 | 膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭减少，抑制体内肿瘤生长 |
近些年，外泌体研究领域发展迅速，来新型外泌体分离技术实现了从小体积样品中快速、高效、精确地分离，在外泌体研究也取得了许多重大进展，这些都使外泌体成为纳米药物、基因要等创新药的递送工具。外泌体技术的发展 对于未来的外泌体的检测、生物标志物筛选以及癌症的鉴别等也都具有重要的意义。
选择外泌体作为给药载体的主要优势在于它可以降低药物浓度，能够准确到病灶部位有效提高效率并减少药物的毒副作用。尽管如此，外泌体的载药效率仍有提升空间。比如：在外泌体研究领域中，由于不同供体细胞分离的外泌体特性也是不同的，需要足够了解与熟悉各种外泌体的 特性，了解外泌体的长期毒性、免疫原性和安全性这也是外泌体药物传递系统DDS设计的重点。
苏州阿尔法生物专注于生物实验室仪器和生物试剂、实验室耗材行业14年。所提供的纳米粒度仪、荧光显微镜等广泛应用于细胞外泌体研究领域。另外，提供的实验室设备包括发酵罐、生物反应器、细胞培养摇床、恒温恒湿培养箱、PCR仪、乳酸分析测定仪等也广泛应用于生命科学实验。
