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酶联免疫吸附试验类型

 更新时间:2023-01-29 点击量:672

酶联免疫吸附测定 (ELISA) 被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法,这种测试一般较为灵敏,通常用于检测和量化物质,包括抗体、抗原、蛋白质、糖蛋白和激素。酶联免疫吸附试验也常用于诊断 HIV 感染、妊娠试验和血型鉴定等。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA 在原理上类似于放射免疫测定 (RIA),但更安全且成本较低。
ELISA 有助于抗原或抗体的定性(存在或不存在)和定量(浓度)测量。
当前使用的酶联免疫分析技术主要有以下几种:
1.直接ELISA
直接和间接 ELISA 都从将抗原包被到 ELISA 板上开始。
步骤:
  •   将抗原添加到板中,在 37 摄氏度下孵育一小时或在 4 摄氏度下孵育过夜。

  •   孵育步骤完成后,下一步是清洗任何潜在未结合抗体的板,并使用 BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他动物蛋白等试剂封闭 ELISA 板上任何未结合的位点。

  •   这一步很重要,因为它可以防止任何非特异性抗体与板结合,并尽可能地减少假阳性结果。添加缓冲液后,重新洗涤板,并添加选定的 酶联检测一抗 。将板进一步温育一小时。

  •   在直接 ELISA 中,主要检测抗体直接与感兴趣的蛋白质结合。

  •   接下来,重新洗涤板以去除任何未结合的抗体,然后向板中添加底物/发色团,例如碱性磷酸酶 (AP) 或辣根过氧化物酶 (HRP),从而导致颜色变化。样品的颜色变化是通过 AP 从底物中水解磷酸基团或通过 HRP 氧化底物而发生的。

  使用直接 ELISA 的优势主要是消除二抗交叉反应,并且由于步骤更少,与间接 ELISA 相比速度更快。它的缺点包括与其他类型的 ELISA 相比灵敏度低,反应成本高。

2. 间接 ELISA
    间接 ELISA 的步骤与直接 ELISA 相同,除了额外的洗涤步骤和去除缓冲液后添加的抗体类型。间接 ELISA 需要两种抗体,一种是粘附在目的蛋白上的检测一抗,另一种是与一抗互补的酶联二抗。
    开始需要加入一抗,然后进行洗涤步骤,再加入酶联二抗并孵育。此后,步骤与直接 ELISA 相同,包括洗涤步骤、添加底物和检测颜色变化。
简要步骤如下:
  • 将含有一抗 (Ab1) 的样品添加到抗原包被的微量滴定孔中,然后附着在孔中的抗原与 Ab1 发生反应。

  • 未结合或游离的 Ab1 都被洗掉,酶标二级抗体 (Ab2) 被添加到微量滴定孔中。

  • 与酶偶联的二抗与一抗结合。

  • 游离或未结合的 Ab2 都被洗掉,并添加酶的特定底物。

  • 形成的有色反应产物的量的测定主要由紫外分光光度计、酶标仪、微孔板读板机等仪器来完成。

       间接 ELISA法也常用于检测血清中是否存在抗 HIV 抗体。与直接 ELISA 相比,间接 ELISA 具有较高的灵敏度,反应成本较低,这种类型的 ELISA 的主要缺点是二级检测抗体之间存在交叉反应的风险。 
3.  酶联免疫吸附试验-夹心式elisa
与直接和间接 ELISA 不同,夹心 ELISA 从包被到板孔上的捕获抗体开始。因为抗原夹在两层抗体(捕获抗体和检测抗体)之间,所以也称为“三明治"。
   流程如下:将捕获抗体添加到板中后,将板盖上并在 4°C 下孵育过夜。包被步骤完成后,用 PBS 清洗板,然后用 BSA缓冲/封闭。缓冲液洗涤在室温下进行至少 1-2 小时。末了,在加入抗原之前用PBS再次洗涤板。
   然后将目标抗原添加到板中以与捕获抗体结合并在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。重新清洗板,然后将检测一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小时在室温下,然后用缓冲液清洗。然后加入酶联二抗,再孵育 1 至 2 小时。重新清洗板,加入底物以产生颜色变化。夹心 ELISA 在所有 ELISA 类型中具有具有较高的灵敏度。夹心式elisa 的主要缺点是会耗费较多的时间和费用,另外这种ELISA 方法,必须要使用配对的抗原(二价/多价抗原)和二抗。
简略步骤如下:
  • 使用夹心式elisa,抗体被固定在微量滴定孔中,而不是抗原。

  • 添加含有待检测或测量的抗原的样品并使其与固定化抗体反应。

  • 清洗孔并加入对抗原上不同表位具有特异性的第二种酶联抗体,并使其与结合的抗原反应。

  • 通过洗涤去除任何游离的二抗后,加入酶特异性底物。

  • 这称为夹心 ELISA,因为待检测的抗原夹在两种抗体(结合抗体和酶联抗体)之间。

  • 末了,通过分光光度计、酶标仪等实验室仪器使用分光光度法来测定有色反应产物。

4. 酶联免疫吸附试验-竞争性 ELISA
  竞争性 ELISA方法主要用于检测血清中是否具有特异性的抗原/抗体。这种类型的 ELISA 会使用两种特异性抗体,一种酶联抗体和另一种存在于测试血清中的抗体(如果血清呈阳性)。将两种抗体结合到孔中将允许竞争结合抗原。颜色变化的存在意味着测试是阴性的,因为酶结合抗体结合了抗原(而不是测试血清的抗体)。没有颜色表明测试呈阳性,并且测试血清中存在抗体。
     该技术中,需要将抗体与溶液形式的抗原(在样品中)一起孵育,然后将该混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。样品中存在的抗原越多,可用于结合抗原包被孔的游离抗体就越少。添加对一抗同种型具有特异性的酶偶联二抗 (Ab2) ,用于确定与孔结合的一抗数量,如在间接 ELISA 中一样。
    竞争性 ELISA 特异性低,不能用于稀释样品。然而,好处是需要的样品纯化较少,它可以测量给定样品中的大范围抗原,可用于小抗原。然而,需要注意的是在该技术中,原始样品中抗原的浓度越高,吸光度越低。 

 酶联免疫吸附试验 ELISA的应用:
1.检测和测量给定样品中的抗原或抗体。(自身抗体:抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等;传染病抗体:抗菌、抗病毒、抗真菌;甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等)
2.检测和估计肿瘤标志物的水平:比如:前列腺特异性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)
  • 检测食品样品中的潜在过敏原。

  • 用于某些类别药物的快速推定筛选。

  • 肽、抗体、激素、蛋白质等物质的检测和定量

  • 外泌体检测、细胞外囊泡检测等

 影响酶联免疫吸附试验ELISA结果的因素有哪些?
主要包括检测板、包被缓冲液、捕获抗体、封闭缓冲液、靶抗原、检测抗体、酶偶联物、洗涤液、底物、信号检测的质量和完整性都会干扰正确的 ELISA 测试。一些可能干扰测试的因素如下:
1.微孔板:孔的形状和质量、板的材料、潜在的预激活、均匀或不均匀的涂层
2.缓冲液:pH、污染
3.捕获和检测抗体:孵育时间、温度、特异性、滴度、亲和力
4.封闭缓冲液:交叉反应、浓度、污染
5.靶抗原:构象、稳定性、表位
6.酶结合物:类型、浓度、功能、交叉反应
7.清洗:污染、频率、体积、持续时间、成分
8.基板:微孔板的质量、材质
9.检测:检测相关的仪器设备:比如:分光光度计、读板机等相关因素
10. 误差:人为误差(实验步骤不规范等)
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