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荧光定量PCR实验中PCR仪器选购技巧

 更新时间:2023-01-31 点击量:855

聚合酶链反应 (PCR) 技术是无数研究和测试实验室的主要技术,涉及的领域包括生物医学、基因编辑、食品微生物学测试 荧光定量PCR技术使用热循环来促进一系列反应,在这些反应中,DNA 样本会快速、呈指数地复制,从而产生数百万或数十亿个序列拷贝。购买PCR仪器时,重要的是要考虑您的应用的最终目标、热循环设备的准确性和效率以及仪器的容量和灵活性。本文概述了 PCR仪器可用的不同选项和功能,以帮助您选购合适的PCR 

1. PCR 与 qPCR 与 dPCR

虽然所有 PCR 系统都使用聚合酶链式反应复制 DNA,但不同的系统使用不同的方法来获得特定的结果。这些不同的方法包括标准 PCR、定量 PCR (qPCR) 和数字 PCR (dPCR)

标准 PCR 仪器通常用于扩增 DNA 以供进一步下游测试和使用;从某种意义上说,这项技术被用作生成产品的一种手段,而不是作为一种分析测试方法本身。扩增的 DNA 只能在 PCR 反应完成后进行测量,而不是实时测量,因此这种方法有时被称为终点 PCR。传统 PCR 扩增的最终产物通常用于下游克隆和测序,也可以使用凝胶电泳进行检查,以在低分辨率(基于条带强度)下确认目标序列的存在及其相对数量。

为了更快速、更准确地定量样品中存在的目标序列的数量,定量 PCR (qPCR),也称为实时 PCR,在扩增过程中使用荧光探针来监测每个热循环后存在的 DNA 数量。通过观察需要多少个循环才能达到特定的荧光强度阈值,分析人员可以在将结果与标准曲线进行比较时确定起始材料中的 DNA 量。 qPCR 还可以比普通 PCR 更快地确认目标序列的存在或不存在,例如 SARS-CoV-2 的检测(使用逆转录首先将病毒 RNA 转化为 cDNA) .

数字 PCR (dPCR) 是另一种定量方法,其中 PCR 反应在数千个独立的反应室中进行,原始样品中 DNA 分子的绝对数量可以根据扩增完成后有多少反应室产生荧光信号来确定与 qPCR 不同,荧光测量不是实时进行的,也不需要标准曲线来量化样品中的 DNA。虽然 dPCR 通常具有有限的通量和比 qPCR 更高的成本,但它在量化 DNA 方面更加精确、灵敏和准确,并且在检测罕见突变和单核苷酸多态性 (SNP) 等应用中有用。

当您考虑您的应用时,决定是选择终点(定性/半定量)PCR 还是定量(qPCR 或 dPCR)方法相对简单,但 qPCR 和 dPCR 之间的选择可能更加微妙。qPCR 具有高通量、经济高效且对许多应用足够灵敏,但如果具有低检测限的绝对量化至关重要,则 dPCR 可能是更好的选择。

2.温度控制的重要性

热循环仪准确有效地调节和控制样品温度的能力是扩增反应成功的关键,应该成为选择任何 PCR 系统的重点。不同的系统可能在升温速率、温度均匀性和准确性以及跨热块实现温度梯度以帮助 PCR 方法优化的能力方面提供不同的能力。

升温速率是指热循环步骤之间温度变化的速度,在仪器规格中通常表示为每秒摄氏度 (°C/sec)。制造商可能会提供有关最大斜率和平均斜率的信息,并区分仪器的上升斜率(加热)和下降斜率(冷却)。

一般来说,更高的斜坡率对应于更快的运行时间,但购买者应注意不要只关注MAX斜坡率而不检查与仪器速度相关的其他指标。仪器可能只会在短时间内达到其较高升温速率,而平均升温速率将更好地反映温度变化的速度。虽然升温速率规格可能给出某些仪器可以运行多快的一般概念,但在可能的情况下,寻找仪器上展示的实际运行时间的数据,以真实地了解高升温速率如何转化为快速分析。朗基T30 PCR仪的升温速度甚至可以达到7.5℃/sec。

温度的准确性和均匀性也是成功反应的关键,虽然所有热循环仪的设计都是为了产生 PCR 所需的温度,但某些功能可以提供更高的置信度,这对于样品可能有限且结果可靠的应用至关重要。当使用PCR仪器进行高分辨率熔解 (HRM) 分析等敏感技术时,精确的温度控制也至关重要。

加热的盖子可以确保整个 PCR 管更好的温度均匀性,因为没有加热的盖子,样品会蒸发并凝结到温度较低的管顶部。热块设计也会影响温度控制;铝块导电性低,这意味着它们将比更导电的块更慢地实现温度均匀性并且具有更低的升温速率。镀银和镀金的虽然昂贵,但可以更快地进行热传递,从而确保整个块的温度分布均匀。

不同的 DNA 目标可能需要不同的温度才能获得较好的扩增结果;例如,富含 GC 的序列需要更高的温度才能变性。理想的退火温度也受到一系列因素的影响——而该步骤的温度通常是根据引物的解链温度、引物对之间解链温度的差异以及试剂浓度、pH 和盐浓度的影响来选择的。使优化反应温度条件成为一项复杂的任务。

具有温度梯度能力的 PCR 仪器旨在通过允许在单次运行中测试多个退火温度来帮助优化 PCR 方法。根据您计划使用 PCR 仪器分析的样品类型和多样性,梯度功能的PCR仪器虽然价格稍高于普通PCR仪,但对工作效率提升不少。比如:朗基系列的 A600系列

3.加热模块

如前所述,与 PCR 仪器一起使用的加热块可以在温度控制方面产生差异,但加热块的设计——以及仪器适应不同加热块的设计——也会影响通量、耗材成本和灵活性。典型的块将采用 96 孔或 384 孔格式,但也可提供其他格式,如 48 孔和 1536 孔。孔数越高,反应体积越小,吞吐量越高,最初成本更高,但由于每个孔使用的试剂量较少,最终会降低每次反应的价格。选择时需要考虑您要处理的样品数量以及您使用仪器的频率

一些PCR仪器带有固定模块,而其他仪器允许使用可互换块,从而提供大的灵活性,可以在 96 孔和 384 孔格式之间或在不同应用的不同块材料之间切换。一些热循环仪还在同一台仪器中容纳多个模块,使不同的协议能够同时在不同的样本集上运行。比如:朗基的Q2000B荧光定量PCR同时用拥有4通道检测,适用低位的PCR管、8联排管或96孔板

由于此组件在温度控制、样品处理和通量方面的关键作用,因此在选择热循环仪时应仔细考虑热块选项。对于样品量较少的实验室,或者那些通常只进行少量检测的实验室,具有标准 96 孔的低成本固定块仪器可能就足够了。然而,模块化、灵活的仪器可能有利于具有更多协议、不同样本量和更多用户依赖同一仪器进行自己的分析的实验室,以及可能希望在未来扩大其通量能力的实验室。

苏州阿尔法生物14年专注生物实验室仪器设备供应和实验试剂、实验室耗材供应的服务商,提供的PCR仪器、荧光定量PCR仪、梯度PCR仪、高通量PCR仪等用于分子生物学研究、生命科学等领域