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细胞培养常见问题汇总

 更新时间:2023-02-02 点击量:736
细胞培养常见问题汇总

1 冷冻管应如何解冻?取出冷冻管后,须立即放入 37 C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除 DMSO?除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基?不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼,请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用 5 %或 10% CO2?或根本没有影响?一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统,而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时,细胞培养时应使用 10% CO2;当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时,则应使用 5% CO2 培养细胞。

7 何时须更换培养基?视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

8 培养基中是否须添加抗生素?除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。

9 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20 C,避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低,并可减少污染之机会。

10 悬浮性细胞应如何继代处理?一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。

11 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?欲回收动物细胞,其离心速率一般为 300xg (约1,000rpm),5 - 10分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。

12 细胞之接种密度为何?依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13 细胞冷冻培养基之成份为何?动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于 DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将 DMSO直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。

14 DMSO之等级和无菌过滤之方式为何?冷冻保存使用之 DMSO 等级,必须为 Tissue culture grade 之 DMSO(如 Sigma D2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 4 C,避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO,则须使用耐DMSO 之 Nylon 材质滤膜。

15 冷冻保存细胞之方法?冷冻保存方法一:冷冻管置于 4 C 30~60 分钟 → (-20 C 30 分钟) → -80 C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 C 至–80 C 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 C 不可超过 1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80 C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

16 细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。

17 应如何避免细胞污染?细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染的好方法。

18 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?加入相应抗生素,直接灭菌后丢弃之。

19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。

20 支原体污染会对细胞培养有何影响?支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为 mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

21 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。

22 CO2培养箱之水盘如何保持清洁?定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

23 为何培养基保存于4℃冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性?培养基保存于4℃冰箱中,培养基内之CO2会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性,而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH 值。

24 各种细胞培养用的 dish,flask 是否均相同?不同厂牌的 dish 或 flask,其所 coating 的 polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。

25 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。

27 收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

28 如何选用特殊细胞系培养基?培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞,很可能在DMEM 或M199 中同样很容易生长。总之, MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养可选 AIMV(12005)培养基(SFM)。

29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

30 GlutaMAX-I 是什么?培养细胞如何利用 GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎降解完成。

31 什么培养基中可以省去加酚红?酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

32 培养基中丙酮酸钠的作用是什么?丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

33 目录上说,Hank’s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和 Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的CO2中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用 Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

34 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

35 当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。

36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

37 大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

38 在溶解的一周内使用贮存在 4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过 30 分钟,就会变得不稳定。

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