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核酸提取试剂盒的工作原理

 更新时间:2023-02-06 点击量:714
核酸提取试剂盒的工作原理

子生物学实验中 qPCR、分子克隆、下一代测序等都需要进行DNA提取。 

  如今,大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒,这些试剂盒使用硅胶自旋过滤法来获得高质量的 DNA。这些可以快速有效地纯化 DNA(或 RNA),在这里需要先了解一下DNA 提取试剂盒的工作原理。

核酸提取试剂盒的工作原理

离心柱包含一种硅胶树脂,可根据盐条件和受提取方法影响的其他因素选择性地结合 DNA 和 RNA。这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 分离方法更容易、更快。但是,使用套件的缺点是,如果您不了解套件的黑匣子中的内容,则会使故障排除变得更加困难。

RNA和DNA提取

裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异,但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。
Chaotropes(离液剂)的作用:Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。
洗涤剂:除了离液剂外,裂解缓冲液中通常还有一些去污剂,以帮助蛋白质溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型,也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,实际上在这些变性缓冲液中效果较好;当蛋白质变性增多,蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而,溶菌酶在变性中不起作用,因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之前进行。

关于质粒制备的注意事项

分离质粒 DNA 与提取 RNA 或基因组 DNA 的提取方式是不相同的,因为必须质粒与基因组 DNA 必须分离。如果此刻,您加入离液剂将立即释放所有物质,并且无法将小环状 DNA 与高分子量染色体区别开来。因此,在质粒制备过程中中,直到裂解后才加入离液剂,盐用于结合。

DNA 提取后纯化:将 DNA 与色谱柱结合

离液盐对于裂解至关重要,而且对于将 DNA(或 RNA)与色谱柱结合也是如此。此外,为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合,还添加了酒精。
大多数情况下这是乙醇,但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多,你会带入大量降解的核酸和小物种,这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少,可能难以从膜上洗掉所有盐分。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污剂,请尝试使用NaCl 作为沉淀剂,以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。

洗涤 DNA(或 RNA)

当裂解物通过硅胶膜进行离心分离,现在所提取的 DNA 或 RNA 应该与柱子结合,杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过了。 
但是,膜仍然被残留的细胞蛋白质和盐弄脏。如果样品来自植物,仍然会有多糖,也许一些色素留在膜上,或者如果样品是血液,膜可能会被染成棕色或黄色。

通过洗涤的方法去除杂质


通常有两次洗涤,尽管这可能因样品类型而异。初次洗涤通常会含有少量的离液盐,以去除蛋白质和有色污染物。 这之后总是用乙醇洗涤以除去盐。
如果开始的准备工作没有大量蛋白质,例如质粒准备或 PCR 清理,则只需要乙醇洗涤。去除离液盐对于获得高产量和高纯度的 DNA 或 RNA 至关重要。一些试剂盒甚至会用乙醇清洗柱子两次。
如果残留盐分,核酸的洗脱会很差,A230读数会很高,导致260/230的比率很低。对于无乙醇 DNA 和 RNA,需要进行干法离心,乙醇洗涤后,大多数方案都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇,对于清洁的洗脱液是必要的。 
当将 10 mM Tris 缓冲液或水应用于膜进行洗脱时,核酸会水合并从膜中释放出来。如果色谱柱上仍有乙醇,则核酸无法再与水融合。如果跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,所以它不会出现在您的读数中。

RNA 和 DNA 提取:洗脱法

DNA 提取方案的还剩余IDE步骤步就是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。
  对于 DNA 制备,通常使用 pH 值为 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定,在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低,低至 4-5,并且高分子量 DNA 在用于洗脱的短时间内可能无法再与水结合。
通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟,可以较大限度地洗脱 DNA。
由于RNA 易溶于水,且RNA 利于处在微酸性的 pH 值环境下。
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