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初代测序技术分类及原理

 更新时间:2023-02-08 点击量:876
1977年Sanger和Gilbert分别提出双脱氧链终止法和化学降解法测序法,标志着初代测序技术的诞生。
 
代测序技术分类
 
Maxam-Gilbert化学降解法测序
 
1. 测序原理:先对DNA片段的5'或3'端进行放射性标记,再采用特异性化学试剂修饰和裂解特定的碱基位点,从而得到一系列有共同放射起点但长度不一的DNA片段混合物,通过对此混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳即可从放射自显影片直接读出DNA碱基序列。
 
2. 碱基序列的识读:聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将DNA片段混合物按片段大小分开,片段越小越接近凝胶底部。因为化学降解反应并非绝对的碱基特异性反应,在识读时需从A+G泳道中扣除G泳道的条带而推断A碱基,从C+T泳道中扣除C泳道的条带而推断T碱基,即若A+G泳道中出现一条带且G泳道中有相同大小的带,则识读为G碱基,若G泳道中没有相同大小的带,则识读为A碱基。[1]
 
 
图1 化学降解法测序反应示意图
在不同点切割相同的DNA标记片段会产生不同大小的标记片段,然后通过凝胶电泳分离片段
 
但由于化学降解法测序技术对待测DNA要求较高、操作繁琐、试剂毒性大、放射性标记率偏低等原因,并未得到广泛应用。
 
Sanger双脱氧链终止法测序
 
1. 测序原理:以待测单链DNA为模板,在引物的引导下依据碱基互补配对的原则,随机引入底物:4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和4种ddNTP(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。在DNA聚合酶的作用下,若引入dNTP则新生链继续延伸,若引入ddNTP则新生链合成终止。因此反应结束后体系中得到一系列长度不一的DNA片段混合物,通过电泳对此混合物按分子量大小分开即可读出DNA碱基序列。
 
 
图2 传统(a) VS 改进后(b)Sanger法测序原理示意图
 
传统Sanger测序采用放射性核素标记引物,分成4管反应体系,通过平板聚丙烯凝胶电泳对PCR产物进行分离。而改进后的Sanger测序采用荧光素标记标记ddNTP或标记引物,荧光素标记ddNTP时可实现4管反应在同一管中进行,通过毛细管电泳对PCR产物进行分离。
 
2. 碱基序列的识读:通过电泳将DNA片段混合物按片段大小分开,传统Sanger测序利用放射自显影技术,人工读取结果:片段越小越接近凝胶底部,由底部向上依次读出新合成链的5'→3'方向的DNA碱基序列。
 
而改进后的Sanger测序利用荧光信号采集技术,自动化读取结果:片段越小越先通过荧光信号采集器,由通过时间的先后和荧光信号自动记录碱基序列。
 
 
代测序技术特点及应用
 
Sanger测序法自面世以来经过40年的不断发展,读长可达1000bp,测序准确度高达99%,是基因序列测定的金标准[2]。但此法的局限在于:只适合对已知突变位点进行检测且只能测出部分变异形式,如检测点突变、小片段插入/缺失;通量低,导致需要获得大量信息的成本较高;灵敏度较低,对于肿瘤样本突变率低于10~15%的变异,检出难度较大[3]
 
随着精准时代的到来,Sanger测序法仍在qPCR检测和高通量测序技术的结果验证、鉴定、微生物种类鉴定和科研等各个方向发挥着重要作用。Sanger测序法为我们打开了合成测序的大门,同时为大规模基因组测序的诞生奠定了基础。
      苏州阿尔法生物实验器材有限公司提供的基因测序仪、凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、PCR扩增仪等广泛应用于初代测序。