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质粒DNA的提取实验方法和步骤

 更新时间:2023-02-14 点击量:1296

质粒DNA的提取实验方法和步骤

一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤。
二、实验原理
从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞:分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100 可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100 处理后,细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互缠绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已分开,复性就不会那木迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
三、主要试剂
1. 溶液Ⅰ:50 mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris (pH 8.0) ,10 mmol/L EDTA(pH 8.0)
2. 溶液Ⅱ:0.2 mol/L NaOH,1% SDS(新鲜配制)
3. 溶液Ⅲ:5 mol/L乙酸钾 60 mL,冰乙酸11.5 mL,水28.5 mL
4. 70%乙醇
5. 氯仿: 按氯仿:异戊醇=24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。氯仿均有很强的腐蚀性。
6. RNaseA:将RNA酶溶于10 mmol/L Tris. (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中,配成10 mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。
7. LB+Amp100培养基:LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解,待培养基温度低于60℃时加入。
四、仪器耗材
恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。
五、实验步骤
1. 从平板上挑取单克隆,加入含有3mL LB+Amp100的试管中,37℃振荡培养过夜。
2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中,4000 r/min 离心2 min。
注:剩余培养物放置4℃,用于保菌。
3. 倒出培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100 μL溶液Ⅰ中,充分振荡混匀,室温放置5 min。
5. 加200 μL溶液 Ⅱ(新鲜配制),盖紧管口,颠倒混匀内容物,将离心管放冰上5 min 。
6. 加入150 μL溶液 Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。冰上放置5 min。
7. 12000 r/min ,离心15 min ,将上清转至另一离心管中。350μL
8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)(去蛋白),反复混匀,10000 r/min,离心10 min,将上清转移到另一离心管中。该步骤可以不做。
9. 向上清加入2倍体积乙醇700μL,混匀后,室温放置15-30min。10000r/min离心10 min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
10. 用500 μL 70% 乙醇轻轻洗涤质粒DNA沉淀,离心10000r/min离心5min弃上清,干燥。
11. 加入适量(20-50 μL)的无菌水,室温使DNA溶解,-20℃保存。
六、注意事项
1. 溶液II需要新鲜配制。
2. 加入溶液II后不能剧烈震荡。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。
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