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DNA克隆技术概述

 更新时间:2023-02-16 点击量:662

  当您听到“克隆"一词时,您可能会想到克隆整个生物体,例如绵羊多利。然而,克隆某物的全部意思就是制作它的基因精确副本。在分子生物学实验室中,常被克隆的是基因或其他小片段DNA 称为DNA克隆。
DNA克隆技术概述
 DNA 克隆技术其实就是基因编辑,是指制作特定 DNA 片段的多个相同副本的过程。在典型的 DNA 克隆过程中,通常会将目的的基因或其他 DNA 片段插入称为质粒的环状 DNA 片段中。插入是使用“剪切和粘贴"DNA 的酶完成的,它会产生一个重组 DNA分子,或由多个来源的片段组装而成的 DNA。
 质粒 DNA 的环状片段在其末端具有与基因片段相匹配的突出端。质粒和基因片段连接在一起,产生含有基因的质粒。这种含有基因的质粒是重组 DNA 的一个例子,或由多种来源的 DNA 组装而成的 DNA 分子。
 接下来,将重组质粒引入细菌。选择并培养携带质粒的细菌。当它们繁殖时,它们会复制质粒并将其传递给它们的后代,从而复制其中包含的 DNA。
在质粒中复制多个 DNA 序列有什么意义?
在某些情况下,我们需要大量 DNA 拷贝来进行实验或构建新的质粒。在其他情况下,DNA 片段编码一种有用的蛋白质,细菌被用作制造蛋白质的“工厂"。例如,人类胰岛素基因在大肠杆菌中表达,来制造胰岛素。
DNA克隆的基本步骤
1.切开质粒并“粘贴"到基因中。这个过程依赖于限制酶(切割 DNA)和 DNA 连接酶(连接 DNA)。
2.将质粒插入细菌。使用抗生素选择来识别占用质粒的细菌。
3.培养大量携带质粒的细菌,并将它们用作制造蛋白质的“工厂"。从细菌中收获蛋白质并纯化。
让我们仔细看看每一步。
1. 剪切和粘贴 DNA
不同来源的 DNA 片段如何连接在一起?一种常用的方法使用两种类型的酶:限制酶和 DNA 连接酶。
限制酶是一种可识别特定的目标序列的DNA 切割酶,许多限制性内切酶产生带有短单链悬垂的切割末端。如果两个分子有匹配的悬垂,它们可以碱基配对并粘在一起。然而,它们不会结合形成一个完整的 DNA 分子,直到它们被DNA 连接酶连接起来 ,DNA 连接酶密封了 DNA 骨架中的缺口。我们克隆的目标是将目标基因(例如,人胰岛素)插入质粒。
   我们从一个环形细菌质粒和一个目标基因开始。目标基因的两端是限制位点,或特定限制酶识别的 DNA 序列。在质粒中,还有一个被同一种酶识别的限制性位点,就在将驱动细菌表达的启动子之后。
   质粒和靶基因都(分别)用限制酶消化。纯化并合并片段。它们具有匹配的“粘性末端"或单链 DNA 悬垂,因此它们可以粘在一起。
DNA 连接酶将具有匹配末端的片段连接在一起,形成一个完整的 DNA 分子。这会产生包含目标基因的重组质粒。
2. 细菌转化与选择
  质粒和其他 DNA 可以在称为转化的过程中引入细菌,例如实验室中使用的无害大肠杆菌。在转化过程中,特别准备的细菌细胞会受到冲击(如高温),促使它们吸收外来 DNA。
    将通过连接产生的 DNA(可能是所需质粒、副产物质粒和线性 DNA 片段的混合物)添加到细菌中。细菌受到热休克,这使它们更容易通过转化吸收 DNA。然而,只有极少数细菌能成功地摄取质粒。
   质粒通常包含抗生素抗性基因,它允许细菌在特定抗生素存在的情况下存活。因此,可以在含有抗生素的营养平板上选择吸收质粒的细菌。没有质粒的细菌会死亡,而携带质粒的细菌可以存活和繁殖。每一个存活下来的细菌都会产生一个小的、点状的群体或菌落,它们都是相同的细菌,它们都携带相同的质粒。
    并非所有菌落都必然包含正确的质粒。这是因为,在连接过程中,DNA 片段并不总是按照我们预期的方式“粘贴"。相反,我们必须从几个菌落中收集 DNA,看看每个菌落是否含有正确的质粒。限制酶消化和PCR等方法通常用于检查质粒。
3. 蛋白质表达
   一旦我们找到了一个带有正确质粒的细菌菌落,我们就可以培养大量含有质粒的细菌。然后,我们给细菌一个化学信号,指示它们制造目标蛋白质。
   细菌充当微型“工厂",大量生产蛋白质。例如,如果我们的质粒含有人胰岛素基因,细菌就会开始转录该基因并翻译 mRNA 以产生许多人胰岛素蛋白质分子。
   选定的菌落在大型培养物(例如 1 升培养瓶)中长大。大型培养物中的细菌被诱导表达质粒中包含的基因,导致基因转录成 mRNA,然后将 mRNA 翻译成蛋白质。由该基因编码的蛋白质在细菌内部积累。
   一旦产生了蛋白质,细菌细胞就可以裂开释放出来。除了目标蛋白(如胰岛素)外,细菌中还漂浮着许多其他蛋白质和大分子。因此,目标蛋白必须经过纯化,或者通过生化技术从细胞的其他内容物中分离出来。纯化的蛋白质可用于实验,或者在胰岛素的情况下,可用于患者。
DNA克隆的用途
通过克隆技术构建的 DNA 分子在分子生物学中有多种用途。主要包括:·
1.生物制药:
DNA克隆可用于制造具有生物医学应用的人类蛋白质,例如上面提到的胰岛素。重组蛋白的其他例子包括人类生长激素,用于无法合成激素的患者,以及组织纤溶酶原激活剂 (tPA),用于预防血栓。像这样的重组蛋白通常是在细菌中产生的。
2.gene therapy:
 在某些遗传病中,患者缺乏特定基因的功能形式。例如,DNA 克隆被用于构建含有在囊性纤维化中无功能的正常基因版本的质粒。当质粒被输送到囊性纤维化患者的肺部时,肺功能恶化的速度减缓.
3.基因分析:
在基础研究实验室中,生物学家经常使用 DNA 克隆来构建基因的人工重组版本,以帮助他们了解生物体中正常基因的功能。
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