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菌种保存常用的五种方法

 发布时间:2023-03-27 点击量:531

各种微生物由于遗传特性不同,因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法,首先应能保持原菌种的优良性状长期不变,同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法:

1.斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完成后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。

放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。

此法由于采用低温保藏,大大减缓了微生物的代谢繁殖速度,降低突变频率;同时也减少了培养基的水分蒸发,使其不至于干裂。该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染。

2.石蜡油封藏法

此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是:150~170℃烘箱内灭菌lh;或121℃高压蒸汽灭菌60~80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1~2年,或更长。这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。

有试验指出,此法用于保藏红曲霉很合适,保藏1~2年后存活率为100%;也有报道显示,某些蕈菌菌丝用石蜡油保藏法,在3~6℃保藏时菌丝易于死亡,而在室温下反而较理想,这是值得注意的。

3.甘油悬液保藏法

此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中,置于低温下保藏,本法较简便,但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃,保藏期约为0.5~1年,而采用-70℃,保藏期可达10年。

将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合,并使甘油的终浓度在10%~15%,再分装于小离心管中,置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。

4.冻干保藏法

冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法,简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中,再在低温下快速将含菌样冻结,并减压抽真空,使水升华将样品脱水干燥,形成燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封,造成无氧真空环境,最后置于低温下,使微生物处于休眠状态,而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件,因此保藏期长,一般达5~15年,存活率高,变异率低,是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外,其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐,技术要求较高,且需要冻干机等设备。

5.液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂,在液氮超低温(-196℃)下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温,并在降到低温之前,使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来,以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时,把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度,以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃,然后保藏在-150℃~-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快,由于细胞内自由水来不及渗出胞外,形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1~10)℃/min,细胞死亡率低;随着速度加快,死亡率则相应提高。

液氮低温保藏的保护剂,一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等,但常用的是甘油(10%~20%)。不同微生物要选择不同的保护剂,再通过试验加以确定保护剂的浓度,原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。

此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上,是目前菌种长期保藏主要技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外,该法适用于各种微生物菌种的保藏,甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏,无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备,且液氮消耗较多,操作费用较高。

要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35~40℃温水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。

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