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使用ipsc诱导多能干细胞生成类器官技术简介

 更新时间:2023-03-31 点击量:653

类器官是复杂的 3-D 器官样微组织,由多种分化的细胞类型组成,其结构组织类似于体内发现的细胞,具有中央腔和其他类似体内的结构特征。从ipsc诱导多能干细胞 产生的类器官已被描述用于胃、肠、肺、大脑、肾、肝脏等各种组织,这些类器官是其他体外模型的有吸引力的替代品;这些微组织比 2-D 细胞培养或简单的 3-D 球体聚集体更好地概括了体内组织表型,但没有与器官外植体或组织切片相关的挑战,例如培养寿命有限。事实上,类器官保留了许多细胞培养的典型有利特征,例如维持稳定培养数月的能力,以及冷冻保存和恢复培养物的能力。类器官也适用于许多标准实验室技术,包括使用 CRISPR/Cas9 进行基因修饰、免疫荧光染色、RNA 表达定量、蛋白质印迹和毒性测定。类器官培养物已被用于基础研究和转化研究。例如,肠道类器官已被证明可在体内植入,用作囊性纤维化模型使用来源的肺 iPSC,并探索宿主与细菌与沙门氏菌的相互作用。 肾脏类器官已用于研究肾毒性,胃类器官被证明是幽门螺杆菌感染的合适模型。在这里,我们简要介绍了一种,用于在特定培养基中结合使用 2-D 和 3-D 培养的方式从三个 人类 iPSC 细胞系( 生成胃肠道 (GI) 类器官。
ipsc诱导多能干细胞 诱导分化培养
简而言之,使用多能干细胞培养基在无饲养层和无血清条件下将iPSC 维持在  细胞基底膜包被的培养皿上。每天更换培养基。在常规 iPSC 培养过程中,细胞每 3-5 天使用干细胞解离试剂传代一次,并作为小聚集体接种。对于类器官的生成,使用了未显示自发分化迹象的低传代 iPSC。


iPSC 诱导分化步骤:
一、定形内胚层分化
根据说明书重构所有利基因子,并在 -80°C 下作为一次性等分试样储存。iPSC 被接种到 Cell Basement 包被的 24 孔多孔板中,并生长至 30-50% 的汇合度。B27 补充剂 和 100 ng/mL 激活素 A 组成的定形内胚层 (DE) 分化培养基替换培养基三天。第一天,DE 培养基还含有 2 µM CHIR99021。培养基是新鲜的并且每天更换三天。
二、后肠球体生成
在 DE 诱导后,通过在 RPMI-1640、B27、100 ng/mL 激活素 A、3 µM CHIR99021 和 500 ng/mL 成纤维细胞生长因子 4(FGF4)中培养四天,生成中/后肠球体。媒体是新鲜的,每天都在变化。
三、后前肠球体生成
在 DE 诱导后,通过在 RPMI-1640、B27、2 µM CHIR99021、500 ng/mL FGF4 和 200 ng/mL noggin 中培养三天,生成后前肠球体。第一天,培养基还含有 2 µM 视黄酸 。每天更换媒体。媒体每天都是新鲜的。
四、肠道类器官生成
收集中/后肠球体并重新悬浮在冰冷、未稀释的细胞基底中。大约 10-20 个球体被镀在 24 孔板的每个孔中,每滴 50 μL。铺板后,将板在 37°C 下保持 15 分钟以使凝胶聚合,在孔中心形成 3-D 圆顶。凝固的凝胶覆盖有预热的完整肠道类器官培养基,该培养基由 Advanced DMEM:F12、N2 补充剂 、B27 补充剂、L-谷氨酰胺、10 mM HEPES 、100 ng/mL 表皮生长因子(EGF)、100 ng/mL noggin和 500 ng/mL R-spondin-1。每 3-4 天更换一次培养基,每 7-14 天通过机械解离将类器官传代到新鲜的细胞基底中。完整培养基在 4°C 下储存不超过三天。
五、胃类器官生成
收集后部前肠球体并重新悬浮在未稀释的细胞基底中。大约 10-20 个球体被镀在 24 孔板的每个孔中,每滴 50 μL。接种后,将板在 37°C 下保持 15 分钟以聚合凝胶,在孔中心形成 3-D 圆顶。凝固的凝胶覆盖有预热的完整胃类器官培养基,包括高级 DMEM:F12、N2 补充剂、B27 补充剂、L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 ng/mL EGF、200 ng/mL noggin 和 2 µM 视黄酸酸。每 3-4 天更换一次培养基,每 7-10 天将类器官嵌入新鲜的细胞基底中。完整培养基在 4°C 下储存不超过三天。
六、免疫荧光和免疫组织化学
细胞单层、球体或组织在 PBS磷酸盐缓冲液中洗涤两次, 并在室温下固定在 4% 多聚甲醛中 15 至 30 分钟。固定的球体/类器官被包埋在石蜡中,以 5-10 µm 切片,并安装在幻灯片上用于后续染色。对于免疫荧光染色,细胞单层或组织切片在含有 5% 驴血清、0.5% Triton-X、0.2% Tween-20 和 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中在室温下封闭和透化 1 小时。一抗在封闭缓冲液中稀释,并在 4°C 下与细胞一起孵育过夜。荧光二抗在封闭缓冲液中稀释,并与细胞在室温下避光孵育 1 小时。使用苏木精、曙红和 PAS-Alcian Blue 进行组织学染色。 
总结
 在体内,DE 产生消化道,是 GI 类器官发育过程中关键的第一步。免疫染色显示,在 DE 分化培养基中三天后,特征性 DE 标记物 FOXA2 和 SOX17 的表达超过 80%,并且中胚层标记物 brachyury(数据未显示)的表达较小。

   在前肠或后肠分化培养基中 3 至 4 天后,形成漂浮或半粘附的球体以及粘附的细长管状结构。后肠分化培养基产生的球体对肠道标记物 CDX2 呈阳性,但对后肠标记物 SOX2 呈阴性,而前肠分化培养基产生的球体为 CDX2-/SOX2+。
在球体嵌入 ATCC 细胞基底膜并保存在类器官生成培养基中后的 7 天内,大的简单圆形类器官变得可见,直径约为 100-200 µm。到第 30 天时,类器官的大小和复杂性大大增加,直径为 1500-2000 µm,并且有许多可见的管状和隐窝/芽状结构。
    30 天以上类器官的免疫染色显示复杂的折叠结构、柱状上皮、隐窝样结构和许多胃肠道标志物的表达,包括前肠标志物 PDX1、后肠标志物 CDX1、MUC1 和 MUC5AC 阳性粘蛋白分泌细胞、溶菌酶 (LYSO) - 阳性潘氏细胞和绒毛蛋白 (VILL) 阳性肠细胞。类器官周围的细胞包含异质细胞群,这些细胞表达波形蛋白 (VIM)、纤连蛋白和平滑肌α肌动蛋白 (α-SMA)。粘蛋白表达仅限于杯状细胞和类器官的中央腔,其中还含有死细胞和碎片. 用 H&E 和 PAS-Alcian Blue 进行的组织学染色显示存在酸性和中性粘蛋白,以及成熟类器官内的组织样形态。

与简单的 3-D 球体或传统的 2-D 培养模型相比,类器官可以更忠实地再现复杂的生理结构。然而,类器官并非没有局限性。虽然 iPSC 衍生的 GI 类器官表现出体内组织的许多特征,但它们不能捕捉成熟组织的表型。例如,它们缺乏体内组织的许多方面,例如脉管系统以及与神经和免疫系统的相互作用。此外,虽然类器官在体内显示出类似细胞的组织结构,但它与原代胃肠道组织中的组织结构并不一致,而且任何单个类器官的大小、复杂性、活力和特定细胞类型的表达都可能存在显着差异。虽然用于生成类器官的分化培养基可能是定义的,但大多数类器依赖于未定义的、小鼠来源的细胞外基质,这限制了它们的临床应用。尽管存在这些挑战,类器官培养方法仍然是一种有用的工具,可以增加我们对器官发育的理解,并为药物筛选或再生医学等个性化医学方法带来希望。
类器官的产生严重依赖于各种利基因素的贡献和特定组织适当信号通路的暂时受限激活。我们发现实验中中使用的许多重组蛋白和小分子的活性存在显着的批次间和供应商间差异。类器官的生成依赖于一系列特定的发育事件,这些事件严重依赖于先前的阶段。特别是,如果iPSC 的 DE 形成的初始步骤不是 80-90%,我们发现类器官生成通常不成功。另外,一些分化标记在类器官达到一定的成熟阶段之前并不明显;我们建议将 GI 类器官培养至少 30 天,在某些情况下,可能需要 60 天以上才能出现完整的细胞类型。
     
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