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慢病毒包装常见问题汇总

 更新时间:2023-04-14 点击量:394

 Q: 什么是MOI?
 
A: 在微生物学中, MOI是病原体(如噬菌体或病毒、细菌等)与感染目标(如细胞)的比率。对于病毒, MOI是病毒颗粒数量与特定空间中存在的目标细胞数量的比率。通常可将某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。
 
  Q:如何稀释病毒?     
                                                                           
A:您可使用完培、PBS液等将病毒稀释到需要的滴度。如将滴度为5 x 109 TU/ml的病毒稀释到1 x109TU/ml,则需取20 µl病毒液加入到80 µl的完培中。
 
  Q:用于病毒感染的细胞接种量是多少?       
                                                     
A: 根据细胞增殖的速度调整细胞接种量,以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系: 传代周期在2-3天,感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右,则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右;针对某些原代细胞: 由于细胞增长缓慢,可以在接种时提高汇合度到50%~ 60%,但要确保在感染后3天时细胞汇合度达到90%~ 100%;针对非分裂细胞: 如神经元细胞,接种后不再增殖,此时可以按照80%的汇合度进行接种。
 
  Q:如何提高病毒对细胞的感染效率?      
                                                        
A:病毒对细胞的感染效率受细胞自身生长的状态,细胞数量,细胞被病毒感染的难易程度等多个因素影响。因此保证细胞生长状态良好,轮廓清晰,合适的细胞密度,选择较好的感染条件(如合适的MOI值)可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞,可采用离心感染方法,减少病毒感染时的体积,从而提高感染效率。如可以在加入病毒后将细胞培养板密封,用离心机在1000g条件下离心1h,再放回培养箱中正常培养。
 
  Q:加入病毒病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理?  
                                               
A:病毒有一定的细胞毒性,如果培养过程中细胞出现了明显的病变或细胞状态变差,建议将转导时间缩短至5~8小时之间。或者调整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小时、 8 小时、 12小时对细胞进行观察,若发现细胞状态变差时,则需要立刻对细胞进行换液操作,使用新鲜的
完培替换病毒感染培养液
 
  Q:细胞能被病毒感染,但为何GFP荧光很弱?
                                                    
A:GFP病毒感染细胞后,细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类等因素。在增殖较慢的细胞中感染病毒后, GFP蛋白表达达到峰值需要较长的时间。 
 
  Q:腺病毒载体在体外实验中应注意哪些问题?    
                                                  
A:由于细胞表面受体的差异,腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同,可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。病毒感染细胞的最佳时期是细胞处于对数生长期时,因此,在细胞消化后12~24小时加入病毒。病毒感染时细胞培养液的体积尽量小一些,以覆盖细胞为准。一般感染腺病毒24 小时后就能检测到目的基因的表达,48 小时表达达到较高水平。
 
  Q:如何确定我所用的目的细胞是否可以被腺病毒感染? 
 
A:腺病毒有广泛的宿主范围,它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞,包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染,例如一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性。为了确认所使用的目的细胞是否能够被腺病毒感染,需要通过带有标记(如GFP)的腺病毒对目的细胞进行预实验。
 

苏州阿尔法生物携手海星提供的服务如下:


|   慢病毒包装服务:
我们可以提供研究所需敲除质粒载体构建和慢病毒包装服务。我们的慢病毒载体来源于HIV-1病毒,序列经过精心优化,提高了生物安全性、基因表达水平和病毒转导效率。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中,实现目的基因的持续稳定的表达目的产物,因此,目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达,干扰和基因敲除。
 
 
|   腺病毒(AV)包装服务:
腺病毒载体(Adenovirus)能够携带大片段外源DNA、感染分裂细胞和非分裂细胞、诱导体液和细胞免疫应答(这对于疫苗开发是有益的)、表现出高效率的转导和高水平的转基因表达、不整合细胞DNA(在细胞内保持dsDNA游离体)。
我们提供第一代腺病毒(E1/E3-deleted Ad5)和嵌合型腺病毒(Chimeric adenovirus)包装服务。Ad5病毒的感染是通过病毒颗粒表面的纤突(Fiber)与细胞表面受体CAR(Coxsackie virus and adenovirus receptor)特异性结合而介导的。 并不是所有细胞都高表达CAR,Ad5病毒在某些不表达或者低表达CAR的细胞种类上的应用受限。我们开发了嵌合型腺病毒,它的感染是通过嵌合型纤突(Chimeric fiber)与细胞表面分子CD46特异性结合而介导的。
 
|  腺相关病毒(AAV)包装服务:
腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒,目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。腺相关病毒主要以游离于染色体的附加形式存在,并可长期存在于非分裂期的细胞中。由于具有高组织特异性、低免疫原性、良好的扩散性、高安全性以及宿主范围广等特点,AAV特别适用于体内的研究,且已成为基因治疗领域中具有前景的病毒载体之一。我们开发出一系列专有技术和试剂,从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺相关病毒包装工艺水平。


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