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原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤

 更新时间:2023-05-18 点击量:651

原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤
1、生长培养好的试验材料(一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片)
2、在拟南芥开花前取样(30片叶子左右即可)
3、切取叶片为0.5-1mm的细条(如果材料能达到每克107个原生质体,10-20片叶子需要5-10mL酶解液)
4、迅速将切下的样品转到酶解液中,要求浸没。
5、黑暗条件下抽真空30min。
6、连续酶解,室温下23℃黑暗中静止酶解3h
7、利用光学显微镜检查原生质体(30-50μm大小)
8、在过滤前加入等量的W5溶液
9、洗干净滤网,并用W5润湿,之后过滤
10、离心100g,1-2min沉淀原生质体,尽可能吸走上清,重复洗2次
11、重悬原生质体于W5中,保持在2*105个/ml,冰浴30min。
12、100g离心2min,尽可能吸走上清,利用MMG重悬,浓度约2*105个/ml
13、加入10μL质粒(1000ng-2000ng)于2ml离心管中
14、加入100μL原生质体(2*104个),轻轻混匀。
15、加110μL PEG solution,轻弹使充分混匀
16、23℃室温孵育30min。
17、加400-440μL W5混匀,终止反应
18、100g,2min 23℃离心,去上清,重复洗一次
19、用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养
20、20-25℃孵育16h以上
21、取样制片观察
 
溶液配制:
1、酶解液的配制(20ml)试剂终浓度质量/g

试剂终浓度质量/g
MES20mM0.08528KOH调pH5.7
D-Mannitol0.4M1.45736
KCl20mM0.02982
macerozyme R-100.40%0.08
Cellulase R-101.50%0.3
55℃水浴10min,待冷却后再加以下试剂
CaCl2·2H2O10mM0.029402
BSA0.10%0.02

W5溶液配制(500mL)

试剂终浓度质量/g
MES2mM0.19524KOH调pH5.7
NaCl154mM4.49988
CaCl2·2H2O125mM9.18825
KCl5mM0.186375

MMG配制(100mL)

试剂终浓度质量/g
MES4mM0.078096KOH调pH5.7
D-Mannitol0.4M7.2868
MgCl2·6H2O15mM0.30495

PEG配制(10mL)

试剂终浓度质量/g
PEG 400040%4
D-Mannitol0.2M0.36434
CaCl2·2H2O100mM0.14701