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琼脂糖凝胶电泳实验步骤

 更新时间:2023-05-19 点击量:783

(1)安装电泳管

选择聚含均匀、无气泡、无裂缝、胶面平整并与管壁没有脱离现象的合格凝胶电泳管 插入上电极槽底板的各圆孔中,留1/5在底板上方,保证使电泳管与底板垂直,密封处不 致渗漏。

(2) 加样

可利用上述方法制成样品胶,也可以用如下的一种方法加样。

将样品溶于200mg/ml浓度的蔗糖溶液中,或溶在10%甘油中,然后加在浓缩胶的 表面。

或将熔化的琼脂与样品溶液混合后加在浓缩胶表面。

或用与电泳管内径相近的圆形厚滤纸片,将样品溶液吸收后,紧贴在浓缩胶表面。 如样品是固体,应先溶在浓缩胶缓冲液中,并加入足够量lmol/L的蔗糖溶液,使样 品溶液的比重增大,再加在浓缩胶表面.

加样体积一般不超过100常用虽为2050 含量不超过100,常用量为20 5外拿如果样品是一个多组分的混合物,加样量可增加到200Mgo如果样品是一种抽提液, 必须去除有形颗粒,取可溶部分上样。

必须保证样品溶液具有低电导性,盐浓度不应超过0. 05mol/Lo

目前常用的加样方法是:用稀释5-10倍的浓缩胶缓冲液,使其成lmg/ml的浓 度,再加蔗糖使成浓度,然后在浓缩胶面上有电极缓冲液存在的情况下,用合 适的加样工具如微堇注射器,插入浓缩胶面与上方的电极缓冲液界面处,轻轻地将样品加 在浓缩胶面上.

(3) 加电极缓冲液

样品加入后,在上下两个电极槽中灌注电极缓冲液,缓冲液的温度需与电泳温度一 致。加入缓冲液时应小心操作,不能搅动电泳管中的样品溶液,并不使电泳管上下口留有 气泡。缓冲液的用垃随容器的大小而有异。一般情况下电极槽中的缓冲液量能使电泳管 至少有3/5浸入缓冲液为宜。

(4) 加指示染料

对于诚性系统常用的指示染料为0. 001%漠酚蓝,酸性系统常用的是0. 005%甲基绿 或甲烯蓝。用量为每500ml缓冲液加指示染料1mlD 一般加在上电极槽缓冲液中。

另有一种办法是将染料配制成0. 1%浓度的溶液,每管加5贝,与样品溶液混合后加 入。

(5) 电泳

装配好电极,接通直流电源。碱性系统上电极接负极,酸性系统上电极接正极。


对于直径57mm的凝胶,最初2分钟用1mA/管的电流进行电泳,然后逐渐升高到 25mA/10分钟)。通常5mm X 65mm的凝胶在20 C时用4mA/管进行电泳,大约需

40分钟。

在电泳过程中,常要求电流保持恒定。此时,电压会有升高。如果电流大而产生过高 的欧姆热,影响某些样品时,可以降低电流而延长电泳时间。



琼脂糖凝胶电泳.jpg






可以看岀,由于水的电解在负极产生H2,在正极产生1/2 O2,同时,HA不断消耗。从 两个电极反应可以知道:为了保持缓冲液有几乎不变的缓冲能力,上下电极槽必须足够 大,以盛放足够量的缓冲液。

有时候,我们需要进行长时间的电泳。例如:DNA的分离有时长达10余小时。为了防 止由于电极反应使缓冲能力耗尽从而引起pH的变化影响分离1977年美国匹兹堡大学 T.G. Cooper提出用循环缓冲液的办法来保持缓冲能力不致耗尽,以达到缓冲溶液能较 长期使用的目的。

Cooper的循环缓冲液方法示意见图2-3o

上下两个电极槽的缓冲溶液水平保持恒定,但又没有建立通路。下槽的缓冲液可靠输 液器一滴一滴地滴入上槽。而当上槽的缓冲液增加时,就会经溢流管滴回到下槽,使上下 两槽的缓冲液水平在电泳过程中始终保持恒定。要注意的是,滴入上槽中的缓冲液,必须 不是线状连续的。

凝胶的取出

电泳结束取出电泳管。然后,用配有细长针头并盛有水的注射器,将针头小心地插入 凝胶和玻璃管壁之间,边插入转动管子同时压进一些水,另一端也作同样处理。然后,将管


F套上橡皮管用自来水压力压出凝胶,或用洗耳球压岀凝胶。如果压岀凝胶困难时,注射 器内可装甘油代替水压入凝胶和管壁之间。也可以用一根金属细丝,从凝胶和管壁之间穿 过整个玻璃管,然后,拉紧金属细丝转动玻璃管一周,就能使凝胶脱离管壁,再用洗耳球挤 压,就很容易压出。

也可以将电泳管浸入甲醇中,使凝胶收缩与管壁脱离而取岀,或根据具体条件用别的 办法取出凝胶。但必须注意,无论用何种办法,必须不损伤胶面。特别是浓度低的大孔凝 胶,宙「机械强度差,取岀时应格外小心。

凝胶的染色——分离区带的检出

(1)蛋白质的一般染色方法

固定和染色常可同时进行。因为,染料的溶剂一般就是固定剂.常用的几种染色方法 简述如下:

(i) 氯基黑10B (amido black 10B)7%的醋酸配制0. 5%1%的染料溶液,浸 26小时,染色后用水洗。

7%的醋酸配制1%的染料溶液,96 C保温染色10分钟,可以改善对弱区带的分辨 率。

(ii) 考马斯亮蓝 R-250 (Coomassie brilliant blue R-250)先用 12. 5%三氯醋酸固 定数小时,出现白色沉淀条纹后,在三氯醋酸中滴加少量1 %考马斯亮蓝R-250溶液,过 夜,用此法染色底色很浅,通常染色后不需脱色。

或用0. 25%考马斯亮蓝R-25O的甲醇-醋酸混合液(454ml 50%的甲醇+ 46ml冰醋 )染色2-10小时。

或先用20%磺基水杨酸固定18小时,然后用0. 25%考马斯亮蓝R-25O的无重金属 离子的水溶液染色0. 52小时。或用0. 25%考马斯亮蓝R-2509%醋酸和45%甲醇 混合液染色0. 5-2小时。

(iii) 考马斯亮蓝G-250先在5%三氯醋酸中固定30分钟,水洗几次,然后用1% 该染料的7%醋酸溶液,染色10分钟。或用0.1%该染料的甲醇:水:醋酸(10 10 1 v/v)混合液,染色30分钟。

(iv) 固绿(fast green)1%固绿的7%醋酸溶液,染色2小时。最好在10C以下进 0

(v) 普施安亮蓝RS (Procion brillant blue RS)先在20%磺基水扬酸固定0. 52 小时,然后用1%该染料的10%醋酸和50%甲醇混合液染色12小时。

(vi) 1%考马斯亮蓝R-250溶剂是水甲醇:冰醋酸(5 : 5 2),使用前用滤纸 过滤去除不溶物。柱状凝胶条室温染色至少4小时。1.5mm厚的平板凝胶,室温染色4 6小时。

(vii) 硫酸铜-考马斯亮蓝混合染色液10g硫酸铜定溶于800ml蒸偕水中,再加入 200ml醋酸作为染色贮备液A

3g考马斯亮蓝G-25O溶于900ml甲醇中,再加蒸馋水至1 000ml作为染色贮备液B 使用前等体积搅拌混合贮备液A和染色30分钟至数小时视不同样品而异。

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