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从微生物和细胞中中分离线粒体的基本步骤方法

 更新时间:2023-06-09 点击量:585

在人体内,线粒体是我们身体的“能量中心",它们可以将营养物质转化为ATP等可用能源。除了在人体内外动植物细胞中都能发现线粒体存在。通过从微生物和细胞中分离出线粒体,我们可以更好地了解其内在机制和功能。在本文中,我们将介绍从微生物和细胞中分离线粒体的基本步骤方法。

 什么是线粒体

  自20世纪初被发现以来,线粒体一直被认为是细胞内部的主要能量储备所在。线粒体是由两个膜界限组成的可变形的类囊体结构,在其内侧膜中包含酶群,参与三磷酸腺苷(ATP)的形成。线粒体可进一步划分为许多结构不同的亚种,这些亚种通过形态和功能上的区别进行分类。尽管对线粒体的研究日趋深入,但分离线粒体的技术仍然是研究员工常常需要掌握和精通的技术。

从微生物中分离线粒体的基本步骤方法

在微生物中,将细胞产物进行相对简单地分离是较为容易的。关键的问题在于如何有效地纯化线粒体并且增加其稳定性以进行更加深入的研究。

一、所需材料

l 酵母培养

l 冷冻离心机

l 15 毫升离心管

l 氯化钠 (0.9%)

l 微量移液器

l 冰冷裂解缓冲液

l 摇床

l 线粒体储存缓冲液

l 冰箱

l 15 ml 微量离心管

二、从微生物(酵母细胞)中分离线粒体的步骤方法:

1. 将过夜酵母培养物无菌转移到两个 15ml 离心管中。

2. 在 4°C 下以 500g 离心 10 分钟。

3. 小心去除上清液,不要干扰沉淀。

4. 使用微量移液器在 1ml 氯化钠 (0.9%) 中小心冲洗沉淀。

5. 使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。

6. 将沉淀重悬于 1ml 冰冷的裂解缓冲液中,并使用微量移液器充分混合。

7. 在 4°C 的摇床上孵育 10 分钟。

8. 在 4°C 下以 1000g 离心 10 分钟,小心去除上清液。

9. 将细胞沉淀重悬于 1.5 ml 冰冷的破碎缓冲液中,并使用针头的钝端完成细胞破碎。

10. 将裂解物在 4°C 下以 1000g 离心 10 分钟。

11. 将上清液转移到新鲜的 15mL 管中,并混合从步骤 7 中获得的上清液。

12. 在 4°C 下以 6000g 离心 10 分钟并弃去上清液。

13. 用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。

14. 在 4°C 下以 6000g 离心 20 分钟。

15. 将沉淀重悬在线粒体储存缓冲液中并储存在 -20°C。

细胞中分离线粒体

三、从细胞培养物中分离线粒体

1.所需的生物试剂/实验试剂

l 1 升冷 STE,具有以下成分:

l 250 毫米蔗糖 = 85.58 克/升

l 5 毫米 Tris = 0.606 克/升

l 2 毫米 EGTA = 0.76 克/升

l 使用 4˚C milliQ实验室纯水,pH 值至 7.4,使用 2 M HCl,置于冰上

2. 从细胞培养物中分离线粒体的具体方法

1. 在 3 x 500 cm2 组织培养板中使细胞生长至 85-95% 汇合度

2. 在生长时,吸出所有培养基。

3. 用 30 ml 冷 STE 清洗细胞单层,吸掉所有 STE

4. 用 30 ml 冷 STE 清洗第二次并吸出

5. 使用干净的刀片从板表面刮下细胞单层

6. 将刮下的细胞重悬于 5 ml 冷 STE 中并转移至离心管 (50 ml) 中。重复两次。

7. 对所有组织培养板重复步骤 2-6,将细胞汇集到离心管中(每 1 个托盘 1 个管)。

8. 在 4˚C 2000 rpm 下旋转细胞 10 分钟。

9. 小心吸出上清液(沉淀略微扩散)并保留细胞沉淀。

10. 在含有蛋白酶抑制剂和 0.5% 无脂肪酸 BSA 的 3.5 ml 冷 STE 中重悬细胞沉淀,转移到冷的 7ml 玻璃-聚四氟乙烯匀浆器中。用 1.5 ml 含 0.5% 无脂肪酸 BSA 的 STE 洗涤试管,然后转移至匀浆器。

11. 通过“紧密"柱塞缓慢通过 10 次使细胞匀浆,并将匀浆转移到 50 ml 离心管中。如果需要,加满冰冷的 STE。

12. 将匀浆在 4˚C 下以 3000 rpm 的转速旋转 3 分钟(1 管)

13. 通过双层湿棉布过滤上清液,并在 4˚C 下以 10000 rpm 的转速旋转 11 分钟(2 管)

14. 倒出上清液并擦拭管内壁。

15. 在冰冷的 STE 中重悬线粒体沉淀,并转移到 15ml 离心管中。加入冰冷的 STE 并以 11,600 G 旋转 10 分钟。

16. 使用冷试管作为杵将线粒体颗粒重新悬浮在残留的上清液中。

17. 将线粒体放在冰上。

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