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3T3-L细胞诱导分化操作步骤

 更新时间:2023-06-14 点击量:443
3T3-L细胞诱导分化操作步骤

3T3-L1 (小鼠胚胎成纤维细胞)是从3T3细胞(Swissalbino)中经克隆分离得到的连续传代的亚系。该细胞从快速分裂到汇合和接触性抑制状态经历了前脂肪细胞到脂肪样细胞的转变。该细胞鼠痘病毒阴性;可产生甘油三酯,高浓度血清可增强细胞内脂肪堆积。可用于研究糖尿病,肥胖症等。
细胞名称:小鼠胚胎成纤维(经成脂分化验证)
细胞简称:3T3-L1
产品货号:TCM-C702
种属来源:小鼠
组织来源:胚胎
细胞形态:成纤维细胞样
生长特性:贴壁生长
培养体系:DMEM-H+10%CS(新生牛血清)+1%P/S
配套培养基货号:TCM-G702
传代比例:1:3-1:4,每2-3天换液一次
传代周期:48-72 h
培养条件:气相:95%空气+5%CO₂,温度:37℃
冻存条件:60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO,液氮储存推荐海星Hycyte® 一步冻存液(即用型、无血清、无需程序降温)

 3T3-L1细胞培养注意事项

细胞密度:细胞密度是影响3T3-L1细胞分化的重要因素,过低或过高的细胞密度都会影响分化效果;密度一般控制在90%的汇合度,如果太低,则会影响细胞生长和分化,如果太高,则会导致细胞死亡和分化受阻。

培养基:3T3-L1细胞最适宜的培养基是DMEM高糖+10%新生牛血清。
传代:3T3-L1细胞的传代次数应该控制在10次以内,否则会影响细胞的生长和分化。在进行传代时,需要注意细胞的消化过程,细胞对胰酶比较敏感,添加胰酶后约1分钟内细胞会脱落,因此消化时间的把控极其重要,同时避免过度打碎细胞团,以保证细胞的生长和分化能力。

3T3-L1细胞成脂诱导分化操作步骤

前脂肪细胞是一类同时具有增殖和分化为成熟脂肪细胞能力的前体细胞,此种前体细胞在不同的生长因子、激素等物质的作用下,经历有丝分裂克隆期、生长停滞期、进一步的克隆期、终末分化四个阶段,细胞本身的成纤维状态发生改变,通过胞质内甘油三脂聚集形成成熟脂肪细胞。诱导完成后,经油红O染色,就可以在镜下观察到甘油三脂脂肪滴的生成。

1.成脂诱导分化操作

1.1 接种干细胞取对数生长期3T3-L1的细胞,按照2.0×10^4cells/c㎡的细胞密度接种至培养器皿,于37℃,5%CO₂培养环境下培养至汇合度90%,弃掉上清,加入成脂诱导分化培养基诱导液。

NOTE:如细胞贴壁性较差,建议使用 0.1%明胶对培养底 面进行包被。

1.2 细胞分化诱导于37℃,5%CO₂培养环境下培养约3天,更换为成脂诱导分化培养基维持液,培养1天后, 再更换为成脂诱导分化培养基诱导液,继续培养3天。
 按照以上换液频率诱导14~21天,并注意观 察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量 和大小,决定终止细胞诱导的时间,并进行染色 鉴定。
2.染色鉴定
2.1 细胞固定吸去培养基使用适量1×PBS清洗一次,弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室 温固定 30~60 min,弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。
2.2 油红O染色取生理盐水或1×PBS与油红O原液配制油红O工作液(油红O原液: 生理盐水=3:2),现用现 配。配制后可对油红O工作液进行离心,以沉淀 染色液中的过饱和析出物。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红O工作液,静置染色30min。吸走油红O工作液,用1×PBS清洗两次,并加入适量1×PBS避免细胞干燥。
2.3诱导评估显微镜下观察成脂染色效果,并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时,脂滴与油红O染料 结合后呈现红色或橘红色。

NOTE: 成脂分化水平因细胞类型、培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。


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