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流式细胞仪荧光结果分析中的常见问题及解决方法

 更新时间:2023-07-07 点击量:2169

   流式细胞仪是一种用于细胞分析的实验室仪器,它能够对单个细胞进行快速而精确的定量和质量分析。它主要通过将细胞悬浮液注入到仪器中,利用激光器照射细胞并检测经过细胞的光线散射和荧光信号,从而获取大量有关细胞形态、大小、复杂度、表面标记以及内部分子的信息。它可同时测量多个参数,并具备高通量性能,能够快速分析数以万计的细胞,并提供详细的统计学数据。它广泛应用于免疫学、细胞生物学、药理学、肿瘤学等领域的研究和实验中。

    然而,在分析流式细胞仪得到的荧光结果时,常常会遇到一些问题,如信号强度弱、背景高、细胞群分布异常等。本文将介绍常见问题,并提供相应的解决方法。

一、信号强度弱

1. 信号补偿不正确:检查流式细胞仪上的单色阳性对照是否设置正确,并确保门控和补偿设置正确。

2. 用于检测的抗体不足:增加抗体的量或浓度。

二、荧光强度高

1. 抗体浓度过高:减少每个样本中添加的抗体量。

2. 过量抗体被捕获:洗涤步骤要充分,并在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton,以保持细胞的透化作用。

3. 封闭不足:在抗体混合液中加入1%-3%的封闭剂,并增加封闭步骤。

三、背景高/阳性细胞百分比高

1. 增益设置过高/补偿过低:使用阳性对照正确设置流式细胞仪,并使用补偿减少小颗粒背景信号和降低增益。

2. 抗体过量:降低抗体的浓度,并在洗涤缓冲液中加入去污剂,确保洗去过量的抗体。

四、在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群

1. 表达靶蛋白的细胞群不止一个:检查样本中包含的细胞类型预期的蛋白表达水平,并确保细胞充分分离。

2. 出现细胞双峰:细胞双峰显示为第二大细胞群,其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。在染色前用移液枪将细胞轻柔混匀,并在细胞仪中运行之前再次混匀。

五、侧向散射背景偏高(来自小颗粒)

1. 细胞裂解:确保样本中的细胞没有裂解和破碎,样本应新鲜并正确制备,避免高速离心或激烈涡旋的操作。

2. 细菌污染:确保样本不受细菌污染,细菌会自动发出较弱的荧光,导致高事件率。

六、低事件率

1. 每毫升的细胞数过少:将细胞稀释至1×105至1×106个细胞/mL,确保细胞均匀混合。

2. 细胞聚集阻塞管道:在染色前轻柔吹打几次,确保得到同源单细胞悬液,也可以筛选或过滤细胞,去除团块。

七、高事件率

1. 细胞数量过多:稀释样本至1×105至1×106个细胞/mL。

   通过以上问题及解决方法,我们可以更好地分析流式细胞仪得到的荧光结果。然而,需要注意的是,不同实验条件可能会导致不同的问题和解决方法。因此,根据实际情况,选择合适的解决方案是很重要的。同时,定期检查和维护流式细胞仪,以确保其正常运行,也是避免问题发生的重要措施。     

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