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免疫组化实验步骤及常见问题分析

 更新时间:2023-07-24 点击量:470
免疫组化实验步骤及常见问题分析
免疫组化实验流程
 
1.样品制备
 
2.组织固定:根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析,冲洗并用固定剂(一般用甲醛)进行固定
 
3.组织包埋:将经甲醛固定的组织嵌入石蜡,以长期保持其天然形状和组织结构
 
4.切片安装:将组织样品在切片机上切片,并转移至载玻片上干燥保持其形态
 
5.脱蜡水化:因切片上的石蜡会妨碍染色,所以需将切片上的石蜡溶出,并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色(一般的脱蜡水化步骤是:将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3,进行脱蜡水化)。
 
6.抗原修复:由于组织在甲醛固定过程中,蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原,使细胞内抗原决定族暴露,从而提高抗原检测率。
 
7.非特定位点封闭:为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性,可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致,室温封闭10-30min。
 
8.样品染色
 
一抗、二抗孵育:抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢,背景较浅;37℃反应较快时间较短;而室温介于两者之间,选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min。
 
底物显色:基于与酶缀合的二抗,抗原通过生色或荧光方式直接检测。
 
复染封片:组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构,常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片,可以长久保存。
 

蛋白质免疫印迹.jpg


免疫组化实验常见问题分析

 
 
1. IHC实验结果显色过深
 
一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间
 
孵育温度过高——选择4℃或室温孵育
 
2. 实验结果存在非特异性显色
 
石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间
 
蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间
 
组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭
 
3. 实验结果显色弱或无染色
 
一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间
 
组织中无目的抗原的表达:一抗种属来源与二抗不匹配
 
免疫组化实验注意事项
 
切片脱蜡和水化要充分,加反应液时要覆盖组织充分;每次加液前甩干洗涤液,同时防止干片。
 
一抗的冲洗原则:单独冲洗,防交叉反应污染;温柔冲洗,防止切片脱落;可采用浸洗方式。
 

有条件的话立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。

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