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荧光定量PCR的优化方法

 更新时间:2023-08-09 点击量:461

使用荧光定量PCR仪进行定量PCR实验时,通常出现效果不佳的情况,下面小编就带你了解一些的PCR实验的优化方法:

一、基本参数的优化

1.1 MgCl2的浓度 在PCR反应中,MgCl2的浓度对影响酶的活性是至关重要的,不仅如此,合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossing point)值,较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的深度选择应慎重

一般来说,对以DNA或cDNA为模板的PCR反应,应选择2-5 mM浓度的MgCl2,对以mRNA为模板的RT-PCR而言,则应选择的浓度为4-8 mM。

1.2 模板的浓度:如果研究者是进行实验,那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验,以选择出最为合适的模板浓度,如果条件困难,也至少要选择两个稀释度(高和中、低浓度)来进行实验。

一般而言,使Cp位于15-30个循环比较合适,若大于30则应使用较高的模板浓度,如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。对于Cp值的确定,经验上是SYBR Green I探针的荧光信号比本底高2倍,杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。

二、使用SYBR Green I测定DNA时的条件优化

2.1 MgCl2的浓度:大多数引物-模板对其的要求是2-4 mM。

2.2 模板的浓度:初次实验要求做一系列的稀释浓度,如条件限制,至少完成两个稀释的度的测定。基因组DNA在50 ng-5 pg之间选择,质粒DNA在106拷贝数左右选择。

2.3 PCR抑制子:通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释,但是在某些条件下,抑制子的浓度高,而模板量少,稀释法就不再能达到好的效果,反会使反应的敏感度降低,所以,研究者若要进行实时定量PCR研究,最好选用纯化的模板。

2.4 引物的浓度:引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素,其浓度太低,会致使反应不完,若引物太多,则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应,0.5 uM是个合适的浓度,若初次选用这个浓度不理想,可在0.3-1.0 uM之间进行选择,直至达到满意的结果。

2.6 退火温度:实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5 ℃,然后在1-2 ℃内进行选择。一般地,退火温度要根据经验来确定,这个经验值往往会同计算得到的Tm值有较大的差距。

三、用SYBR Green I进行一步法RT-PCR的条件优化

3.1 MgCl2的浓度:不同的靶分子选用不同的浓度,通常是在4-8 mM之间选择。

3.2 模板的浓度:RT-PCR实验既可以选用总RNA,又可以选用mRNA,其浓度应在1 pg-1 ug之间选择。对于低模板浓度,可以增加适量的MS2或用alternative RNA 作为载体进行测定。

3.3 对照设置:每一引物都应设有阴性对照,阳性对照和污染对照。

四、杂交探针测定DNA

4.1 MgCl2的浓度:在2-4 mM的基础上加0.5-1.0 mM,但是不要超过2.0 mM。

4.2 杂交探针的浓度:初次实验每个探针用0.2 uM,如果信号强度达不到要求,可以增加至0.4 uM。

4.3 对照设置:每一引物都要设阴性对照,每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照

4.4 其它的条件同SYBR Green I。

五、用杂交探针实时定量RT-PCR

5.1 MgCl2的浓度:在4-8 mM之间进行选择。

5.2 杂交探针的浓度:初实验用0.2 uM,如果荧光信号强度不足,可以增加至0.4 uM。

5.3 模板浓度设置:优化的扩增须进行一系列知释度的实验,在条件有困难的条件下,至少要进行两个稀释度的测定。选用1 pg-1 ug的总RNA或是mRNA,若是模板的浓度过小(小于10 ng/ul),则可加入MS2或alternative RNA作为载体。

5.4 对照设置:每个引物都要设无模板对照,阳性对照以及污染对照。

六、关于杂交探针的评价

在使用杂交探针进行实验时,必须注意防止探针-引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物-探针二聚体的形成,主要是因为探针可与引物的3’末端杂交,其形成以后,会致使此二聚体扩增,从而同目的基因竞争反应的原料,致反应的效率下降。

探针其本身能同目的基因相结合,且其解链温度高于引物,所以它可能作为引物而引发延伸反应,为了防止发生这种现象,通常是将其3’末端全磷酸化,使之不能延伸,若此磷酸化不全或是没有磷酸化,就会产生目的基因的副产品,从而干扰实验结果。鉴于以上这两点,所以应对探针精心设计,并将其末端全磷酸化。