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PCR产物纯化实验步骤

 更新时间:2023-08-11 点击量:1007
PCR反应中目基因的获取实验
一、实验目的
掌握PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应,可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是,首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链,DNA样品中,特异性的引物能够与其互补的序列杂交,在dNTPs和Taq酶存在时,就可以合成模板DNA的互补链,反应完成后,将反应混合物加热使DNA双链变性,温度下降后,过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次,使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1. 变性:加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火:使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs),按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA。
上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTPs、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
三、 试剂和缓冲液
PCR mix,10×PCR Buffer,引物,模板。
四、 仪器耗材
PCR仪,掌上离心机,微量移液器,枪头,1.5mL离心管,PCR管,冰盒。
五、 实验步骤(每人一组,每人做1管,纯化时两人一组)
1. 查找基因序列,设计合成PCR引物。注意合成引物约需一周时间,请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μL反应体系中,加入:
模板DNA (5ng/μL)        1   
引物P1P2 (10μmol/L)    各1   
2×PCR mix              25 
ddH2O                  22 
在冰上配制,注意混匀后离心。加入10μL石蜡油覆盖。
3. 在PCR仪中预变性94℃ 4min,然后循环:94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 60s,30个循环;循环结束后,72℃10min 。扩增的PCR产物4℃保存。(OC-II)
4. 取PCR产物2-5μL与上样缓冲液混合,点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳,160V 30-40min。
6. 电泳结束,溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. PCR产物切胶回收。步骤参见胶回收Kit说明书。
A 酶切片段的纯化及其回收
使用切胶回收kit进行PCR产物的回收。具体操作步骤如下,详见说明书。
1)称回收的胶,每0.1g加100µL XP2 ;
2)55度5-7分钟至溶胶 ;
3)取溶胶液加入回收柱子,最大体积700µL;10000g, 1min;
4) 加300µl XP2 ,10000g 1min;
5)加700µl SPW ,10000g 1min;
6)重复5);
7)空管离心2min,13000 g
8)干燥,加15-30µL  Eulation Buffer
9)13000 g,1min
 
DNA产物纯化kit,操作步骤:
将PCR反应液(40ul)或酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中,加入5倍体积的buffer3,充分混匀。(用前确定加入适量的异丙醇)
将混合液全部移入吸附柱,8000g离心30s;将滤出液再次加入到吸附柱中再次过柱,8000g离心30s(此步骤可以提高回收效率);倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中。
向吸附柱中加入500ul Wash Solution(加到壁上),9000g离心30s。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中。(Wash Solution使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇)
重复步骤3一次
将空吸附柱和收集管放入离心机,9000g离心1min。下管扔掉,上管放入1.5ml离心管中,晾干。(残余的乙醇会严重影响得率和后续试验)
在吸附膜中央加入25ul 60℃提前预热(进一步提高得率)的Elution Buffer(加到滤芯上),室温静置1min,9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。注意:本步骤中,所有转速单位为g。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法对PCR产物回收。具体操作步骤如下。
加入等体积的冰无水乙醇,加入1/10体积的KAc(3M  pH5.2)。
上下颠倒混匀,-20℃30min;12000r/min 4℃ 10min。
弃上清,加入70%的冰乙醇,轻轻混匀。12000r/min 4℃离心10min。
弃上清,室温干燥,至无乙醇。
加入适量体积的ddH2O。六、注意事项
1. 进行PCR反应时,注意加入试剂的顺序。注意加入任何一种试剂后均需混匀。
2. 本实验使用2xPCR mix,包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀释:分子量24bp*324.5 = 7788,质量数10OD*33 =33ug,摩尔数=33/7788 =4.2 nmol,母液浓度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L,使用时取母液稀释5倍,则终浓度为10μmol/L。
4. PCR扩增产物共20μL,其中2-5 μL用于检测,剩余的用于纯化回收。具体步骤参考 实验二C内容。
5. 使用自己的实验材料进行PCR扩增的学生,请提前准备引物和模板,并与任课教师协商。
思考题:
影响PCR反应特异性的因素有哪些?请分析原因及解决办法。
PCR引物设计的原则有哪些?请设计本实验的PCR引物,并写到实验论文中。 
附1:基因序列查找和PCR引物设计
实验课进行之前,需要利用NCBI查找基因序列,并设计PCR引物。

进入NCBI 后,在Search的下拉框中选择Nucleotide,再输入基因名称,点击Search即可。也可输入具体的物种名以缩小范围,获得cDNA 序列信息。例如:水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(Oryzacystatin, OC)序列信息


OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA
引物设计。要求扩增上述完整的cDNA 序列,并在两端添加酶切位点,5‘添加EcoRI(GAATTC), 3‘端添加HindIII (AAGCTT)。以便克隆到pET30a的相应位点。注意PCR产物中没有上述酶切位点,否则不能使用。
prim-OC2-R   GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC    26bp  下划线为EcoRI识别序列
#prim-OC2-F   GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC    26bp  下划线为HindIII 识别序列
 
T载体通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA


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