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研究生实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

 更新时间:2023-08-15 点击量:667

大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

一、实验目的

    通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。获得感受态细胞;制备含有目的片段的阳性克隆。

二、实验原理

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(RˉMˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2RbCl (KCl) 等化学试剂法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)CaCl2 法简便易行,且其转化效率全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。

转化率的计算:

统计培养皿中的转化子数,转化后在抗生素的平板上长出的菌落即为转化子。

转化子总数=菌落数×稀释倍数(转化反应原液总体积 / 涂板菌液体积)

转化频率(转化子个数/μg质粒DNA= 对照2转化子总数 / 质粒DNA加入量(μg

感受态细胞总数= 对照1菌落数×稀释倍数

感受态细胞转化效率= 转化子总数 / 感受态细胞总数

为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素:

1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4的培养菌,最好从-70℃-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。

2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ngcccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

本实验以E.coli TOP-10菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC质粒共保温,实现转化。由于pUC质粒带有氨苄青霉素抗性基因 (Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了pUC

三、主要试剂

E.coli(Top-10, DH 5a)CaCl2、无菌水、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂、氨苄青霉素。

四、仪器耗材

控温摇床(37℃)、冷冻离心机50mL转子)、水浴锅、冰箱(-20-70℃)、超净工作台、培养箱(37℃)、分光光度计、液器、枪头、离心管、三角瓶、6cm平皿、酒精灯、三角玻棒、酒精棉球、火柴

五、实验步骤

感受态细胞制备:

1. 第一天:从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。

    2. 第二天:取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养。2-3 h,测定OD600 ≤ 0.4-0.5,细胞数务必 ≤108mL。(此为实验成功的关键)

3. 将菌液转移到50 mL离心管中,冰上放置10 min

4. 离心10 min4000r/min4℃,倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽,回收细胞。

5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 10 mL悬浮沉淀,立即放在冰上30 min

6. 4℃ 6000 r/min,离心10 min,回收细胞。

7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2 mL悬浮细胞,务必放在冰上。此细胞为感受态细胞。

8. 分装,每管200 μL。可以加入15%甘油-70度保存。

转化:

9. 200 μL新鲜制备的感受态细胞,加入连接产物10μL~50 ng )混匀冰上放置30 min

同时作2个对照管:

对照1:200 μL感受态细胞+ 10μL无菌水(不含氨苄皿)每班做一个

对照2:200 μL 感受态细胞+ 1μL 标准质粒DNA溶液(10ng/μL)每班做1-3个

10. 将管放到42℃循环水浴90-120sec。

11. 冰浴2 min。(提前准备好)

12. 每管加600 μL LB液体培养基,37℃培养1 h(慢摇)。

13. 将适当体积已转化的感受态细胞,离心后涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。(提前倒好平板)

注意:对照1涂不加氨苄的平皿,菌液不离心,取1-10μL涂;

对照2涂氨苄平皿,菌液不离心,取5-20μL涂。

14. 倒置平皿37℃培养12-16 h,出现菌落。

15. 计算阳性对照的转化频率。

16. 记录样品的转化子总数。

六、注意事项

1. 无菌操作。

2. 低温操作。

3.注意加Amp时的温度,温度不能过高(55-60度),否则抗生素失活,会使克隆株无法筛选出来。

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