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使用PCR仪进行基因扩增的实验方法

 更新时间:2023-09-12 点击量:454

实验室常用 DNA 聚合酶有三种:TaqTM , EXTaqTM  和  Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶, 保真性较差 , 但价钱便宜, 一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proofreading  活性的耐热性 DNA 聚合酶, 具有一定的保真性, 而且其扩增得到的 PCR 产物 3 ’ 端附有一个 “A" 碱基 ,如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proofreading 活性的耐热性 DNA 聚合酶, 其特点是保真性高,扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。


1.   按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液:


TaKaRa TaqTM  TaKaRa EXTaqTM 的配方

 

Reagent

Quantity, for 50µl of reaction mixture

10X PCR buffer Mg2+  free

5 µ l

 

MgCl225mM

 TaKaRa TaqTM  3 µl

 TaKaRa EXTaqTM  4 µl

2.5mM dNTP mix

4 µ l

10µM Primer  上游

1 µ l

10µM Primer 下游

1 µ l

Template DNA

1 µ l

Taq  EXTaqDNA Polymerase

0.25 µl

Sterile deionized water

Up to 50µl

Total

50 µl /Sample

merase 的配方

 

Reagent

Quantity, for 50µl of reaction mixture

10X Pyrobest buffer

 l

2.5mM dNTP mix

 l

10µM Primer 上游

 l

10µM Primer  下游

 l

Template DNA

 l

Pyrobest TM DNA Polymerase

0.25µl

Sterile deionized water

Up to 50µl

Total

50µl /Sample

 



① 反应总体积根据实际情况进行调控,可以做 20~50µl 以节约试剂;

② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中;


③ 如果不用 PCR 仪的加热盖,在反应混合液的上层加 30 ~50µl  的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发;


2.   按以下程序进行 PCR 扩增。

PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异, 在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR 结果而进行优化。

 

 

Step

Temperature,

° C

 

Time, min

Number of

cycles

Note

起始变

 

94~95

 

1-3

 

1


变性

94~95

0.5-2

 

 

 

 

25-35

退火温度比理论退火 温度大概低 C ,再

根据反应结果优化

 

退火

 

37-70

 

0.5-2

 

延伸

 

70-75

根据扩 增产物

的大小

每分钟延伸 1000bp

最终延

 

70-75

 

10

 

1


 




反应结束后,抽取扩增样品 5µl,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存,以备以后分析使用。

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