实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaqTM ， EXTaqTM 和 Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶， 保真性较差 ， 但价钱便宜， 一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proofreading 活性的耐热性 DNA 聚合酶， 具有一定的保真性， 而且其扩增得到的 PCR 产物 3 ’ 端附有一个 “A" 碱基 ，如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proofreading 活性的耐热性 DNA 聚合酶， 其特点是保真性高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。
1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液：
TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方
Reagent | Quantity, for 50µl of reaction mixture |
10X PCR buffer （Mg2+ free） | 5 µ l |
MgCl2（25mM） | 如 TaKaRa TaqTM 加 3 µl |
如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 µl | |
2.5mM dNTP mix | 4 µ l |
10µM Primer 上游 | 1 µ l |
10µM Primer 下游 | 1 µ l |
Template DNA | 1 µ l |
Taq 或 EXTaqDNA Polymerase | 0.25 µl |
Sterile deionized water | Up to 50µl |
Total | 50 µl /Sample |
merase 的配方
Reagent | Quantity, for 50µl of reaction mixture |
10X Pyrobest buffer | 5µ l |
2.5mM dNTP mix | 4µ l |
10µM Primer 上游 | 1µ l |
10µM Primer 下游 | 1µ l |
Template DNA | 1µ l |
Pyrobest TM DNA Polymerase | 0.25µl |
Sterile deionized water | Up to 50µl |
Total | 50µl /Sample |
① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50µl 以节约试剂；
② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中；
③ 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~50µl 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；
2. 按以下程序进行 PCR 扩增。
PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异， 在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR 结果而进行优化。
Step | Temperature, ° C |
Time, min | Number of cycles | Note |
起始变 性 |
94~95 |
1-3 |
1 | |
变性 | 94~95 | 0.5-2 |
25-35 | 退火温度比理论退火 温度大概低 5°C ，再 根据反应结果优化 |
退火 |
37-70 |
0.5-2 | ||
延伸 |
70-75 | 根据扩 增产物 的大小 | 每分钟延伸 1000bp | |
最终延 伸 |
70-75 |
10 |
1 |
反应结束后，抽取扩增样品 5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
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