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大肠杆菌质粒 DNA 的提取(碱裂解法)

 更新时间:2023-09-14 点击量:405


 

此方法适用于小量质粒DNA 的提取提取的质粒 DNA 可直接用于酶切PCR 扩增。

1.   1.5ml 细菌培养物于 EP 管中, 4000rpm  离心 1 分钟, 弃上清液, 使细菌沉 淀尽量干燥;

2.   将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 μl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖, 10 mmol/L EDTA pH 8.0 25 mmol/LTris-HCl pH 8.0)  中,剧烈振荡;

3.   加入 200 μl 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH 1SDSm/v),盖紧 EP 管 口,快速颠倒离心管 5 次,以混合混合物,确保离心管的整个内表面与溶液 II 接触,不要涡旋,置于冰浴中;

4.   加入 150 μl 预冷溶液 III(100 ml  的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L   乙酸钾,11.5 ml 冰乙酸, 28.5 ml H2O),盖紧 EP 管口,反复颠倒数次,使溶液 III 在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上 3~5 分钟;

5.   在最大转速下离心 5min,取上清液于另一新 EP 管;

6.   用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA,振荡混合于室温放置 2 分钟, 最大转 速离心 5 分钟;

7.   小心吸去上清液,将离心管倒置于滤纸上,以使所有液体都流出,在将附于管壁的液滴除尽;

8.   1ml 70%乙醇洗涤沉淀,振荡混合,用 12,000g 离心 2 分钟,弃上清,将 开口的 EP 管置于室温使乙醇挥发, 直至 EP 管中内没有可见的液体存在(5 ~ 10 分钟),用适量的 ddH2O 溶解;

9.   0.5μl RNase 37℃温育 5~10 分钟;

10. 电泳鉴定。

乙醇沉淀DNA

1.    加入 1/10 体积的乙酸钠(3molLPH=5.2)于 DNA 溶液中充分混匀, 使其 最终浓度为 0.3 molL

2.    加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中 15~30 分钟;

3.    12,000 g 离心 10 分钟,小心移出上清液,吸去管壁上所有的液滴;

4.    加入 1/2  离心管容量的 70%乙醇, 12000g  离心 2 分钟, 小心移出上清液, 吸 去管壁上所有的液滴;

5.    于室温下将开盖的 EP 管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干;

6.    加适量的 ddH2O 溶解 DNA 沉淀。

 

1.   酶切前确定待切样品的浓度,  并选择合适的限制性内切酶和配套 Buffer2.   在离心管中加入如下成分:

10 ×Buffer     1μl

待切样品  xμl

       0.5-1μl

加水补足 10μl

3.   混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。

4.   将离心管置于 37℃中温育 1-3hr,若待切样品为 PCR 产物, 则可将反应时间 适当延长。

5.   用未酶切的质粒作为对照,琼脂糖电泳鉴定酶切结果。

注:当酶切样品用于回收而不是鉴定时,可按比例适当加大反应体积。双酶 切可选用二者活性都较高的 Buffer 或者通用 Buffer,但要注意不能有星反应。)

1.   连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。

2.   在离心管中加入如下成分:

10 ×连接 Buffer 1μl

待连接的样品(胶回收产物或 PCR 产物,载体与片段的 mol 比为 13-5

连接酶 0.5-1μl                                                                            

加水补足 10μl

3.   混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

4.   将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间(根据不同公司的酶的要求

而定, 一般为 221-3hr 16℃连接过夜)。

连接完的样品可直接用于转化,也可放 4℃冰箱短期保存。