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单细胞RNA测序技术原理和方法

 更新时间:2023-11-08 点击量:596

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种高分辨率的技术,用于研究细胞内个体基因的表达模式。它允许对单个细胞进行基因表达谱的分析,揭示了细胞异质性、细胞类型和基因调控网络。

单细胞RNA测序技术原理:

单细胞RNA测序的基本原理是将每个单个细胞的RNA捕获和测序。它主要包含以下步骤:细胞分离、细胞裂解和RNA捕获、逆转录和扩增、文库制备和测序、数据分析。

1. 细胞分离:

单个细胞通常通过荧光活化细胞分选(FACS)或微流控滴系统等方法进行分离和排序。这些技术可实现单个细胞在独立的孔或微流控腔室中的分离。

2. 细胞裂解和RNA捕获:

分离的单个细胞经过细胞裂解,以释放RNA分子。对于捕获和条形码化每个单个细胞的RNA分子,可以使用不同的方法,例如基于微流控平台的inDropsDrop-seq或使用微孔。 

3. 逆转录和扩增:

释放的RNA分子通过逆转录反应转化成互补DNAcDNA),逆转录过程中使用包含分子标识符(UMIs)的寡聚dT引物。UMIs有助于在后续步骤中区分和消除潜在的扩增偏差。随后,经过扩增来产生足够用于测序的cDNA

4. 文库制备和测序:

扩增的cDNA被片段化,并且接入测序适配体。经过文库制备后,可以利用高通量测序平台(如Illumina测序仪)对文库进行测序,以获得RNA序列信息。

5. 数据分析:

从测序设备中获取的数据需要经过一系列计算分析。通常包括质量控制、比对、表达量定量和归一化等步骤。使用单细胞生物信息学工具对这些数据进行分析,以识别和分析单个细胞的基因表达谱。

单细胞RNA测序方法:

单细胞RNA测序的方法主要分为三类:分液法、微孔法和流式细胞排序结合扩增法。分液法使用微型通道将单个细胞隔离到独立的小液滴或腔室中,然后进行RNA测序。微孔法通过将单个细胞分离到微小孔洞中进行RNA捕获和测序。流式细胞排序结合扩增法则是利用流式细胞分选技术将单个细胞分离到96孔板中,并进行扩增和测序。



测序设备及应用:

在单细胞RNA测序中,常用的设备主要包括荧光定量PCR仪、细胞分选仪(如FACS)、微流控滴系统、PCR仪、基因测序仪和计算机等。细胞分选仪用于将单个细胞分离和排序,微流控滴系统用于单细胞RNA分子的捕获,PCR仪用于逆转录和扩增步骤,测序仪用于生成RNA测序数据,(续)在细胞发育领域,单细胞RNA测序可以帮助研究器官和组织发育过程中细胞的分化轨迹和细胞命运决定。它可以鉴定并追踪不同细胞类型的转录组动态变化,揭示细胞分化和多能性维持的机制。

在医学研究方面,单细胞RNA测序可以帮助医学鉴定相关细胞亚群及发生和进展的关联。例如,在肿瘤学中,单细胞RNA测序可以揭示肿瘤细胞的异质性和逃逸机制,有助于发现潜在的靶点。

   在免疫学中,单细胞RNA测序可以帮助鉴定和描述免疫细胞的次群,并解析不同免疫细胞在免疫应答中的作用和相互作用。这有助于我们更好地理解免疫系统的调控和免疫机制。

   在神经科学中,单细胞RNA测序可以用于研究神经系统中不同细胞类型的功能特征和转录组变化。这有助于我们理解神经系统发育和功能编码的分子机制,以及神经系统研究。

单细胞RNA测序的发展离不开高通量测序技术的支持。目前,Illumina测序仪是常用的测序仪之一,它具有高度灵敏性和准确性,适合用于单细胞RNA测序。同时,搭配上一系列的前处理和数据分析工具,如SeuratScanpyCell RangerMonocle等,可以对单细胞RNA测序数据进行高效的数据处理、可视化和生物信息学分析。

     单细胞RNA测序是一种近几年热门的生物技术,可以帮助我们了解细胞的异质性、细胞类型和基因调控网络。它在细胞发育、疾病研究、免疫学和神经科学等领域具有广泛的应用前景,有助于推动我们对生命科学的深入理解。更多相关产品请进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司网站进行了解。