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蛋白纯化亲和层析原理

 更新时间:2024-04-22 点击量:89
亲和层析原理:
亲和层析是应用生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统。伴有杂质的高分子分离目的物在一定条件下,能以某种次级键与已固定化的配基结合,而杂质则不被吸附。分去杂质后更换条件,又可使高分子物质重新解离,因而获得纯化。
亲和层析更适用于从某些组织匀浆或发酵液中,分离相对含量低、杂质与纯化目的物之间的溶解度、分子大小,电荷分布等物化性质差异较小,其它经典手段分离有困难的高分子物质。因亲和层析专一性高,操作简便,时间短,得率高,故对分离某些不稳定的高分子物质,更具优越性。

下图中圆球表示载体,球上黑色箭头表示配基。当各种不同功能的高分子物质(分别以方块、半圆和三角缺口来表示配基结合部位)通过时,只有带三角缺口的高分于物质能与固相上的配基专一结合,其它高分子物质则不受阻碍地流出,然后改变洗脱条件使分离目的物解离而洗脱下来。

蛋白纯化亲和层析法原理

二、蛋白层析载体
1,载体要求
(1)非专一吸附要小、高度亲水,惰性
(2)具有大量可供活化和配基结合的化学基团
(3)有稀松的网状结构使大分子能自由进入。
(4)有较好的化学稳定性,能经受亲和层析时所用条件
(5)良好机械性能,颗粒均匀。

(6)对酶及微生物侵蚀稳定,价格合理。

组氨酸标签蛋白亲和纯化介质 Ni-IDA-Beads


2,蛋白纯化亲和层析载体简介

(1)多孔玻璃载体
玻璃对酸碱、有机溶剂及生物侵蚀非常稳定,并且本身义特别坚硬,易于化学键合连接分子臂,是一极为理想的载体。但由于价格昂贵,而且有时呈现SiOH基的非特异性吸附,这是最大的缺点。由于其应用上具极大优点,克服缺点方面的研究正在进行中
(2)聚丙烯酰胺凝胶载体
丙烯酰胺和 N,N-甲叉双丙烯酰胺的共聚物是一种良好的载体。具有三向网状结构和碳氢骨架面,它的大量酰胺基支链非但使凝胶具有亲水性,且可供活化。但在配基偶联后网块缩小不利于亲和层析是其缺点。
(3)纤维素载体
多糖类载体目前应用,纤维素是其中较为划算的一种可作为固相载体的物质。但纤维素作为亲和层析载体尚有许多缺点,首先活化后会产生带电荷的离子而物理结构又较紧密。虽然较小的配基能引入纤维素,但是蛋白和核酸的通透性则受空间位阻所阻碍。因此高度取代的配基并不能保证高容量的吸附,特别是配基和吸附物都是蛋白时更是如此。
(4)葡聚糖凝胶载体
葡聚糖凝胶是用环气氯丙烷作为交联剂,把多聚葡萄糖交联而成的珠状凝胶。其化学性能及物理稳定性都比较好,但多孔性能较差。最松散的结构如Sephadex G-200,也只能让分子量6X105的球蛋白通过。在配基偶联上去后,凝胶膨胀度将进一步缩减,故其应用范围和纤维素载体相同,都有一定的局限性。葡聚糖凝胶只适合与小配基制成亲水吸附剂以及免疫吸附系统,由于用在这方面容量和通透性的要求都不高,一般较常用。(5)琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶载体
琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3,6-脱水-半乳糖相间结合的链状多糖。它高度亲水,具有极松散网状结构,可以让上百万分子量的大分子通过。物理和化学性能都比较稳定。通过溴化氰及环氧乙烷类试剂活化,引入活性基团,并在极温和条件下连接上较多配基,吸附量较大。在非专一吸附方面,如果缓冲液离子浓度不太高,它对蛋白质几平没有吸附作用,在室温用1mol/L的强酸或强碱处理2~3h不会引起颗粒性质的变化。用较浓的尿素或盐酸胍长期处理,亦不引起吸附性能的减弱,即使用蛋白变性剂洗脱大分子物质亦不致引起破坏,这就保证了吸附剂可以反复使用。珠状琼脂糖凝胶的缺点是它不能象葡聚糖凝胶一样进行干燥和冻干,且经不起有机溶剂处理,因为有机溶剂处理可引起珠状凝胶严重不可逆碎裂。因此人们就用类似葡聚糖凝胶的交联方法发展出另一更为理想的交联琼脂糖凝胶,它具有上述凝胶的优点面减少其缺点。

三,亲和吸附和洗脱

葡聚糖凝胶

   纯化蛋白质的亲和层析基本用柱法。在上柱时应选择配基和目的物之间作用的离子强度和pH组成,使最有利于形成亲和络合物,一般则选取中性pH作为吸附条件。样品应溶于亲和层析柱的平衡缓冲液中,或用平衡缓冲液进行透析。上柱速度尽可能慢,对温度不敏感的物质,室温纯化即可;对温度敏感的物质,可以采用在4℃下纯化,通常的亲和层析图谱如下图。

亲和层析图谱

     样品上柱后分离目的物先紧密地吸附在亲和柱上,用平衡缓冲液洗涤时层析谱上出现第一个杂蛋白的峰。继续用大量平衡缓冲液充分洗涤,必要时用不同缓冲液洗涤以除去非专一吸附的杂质,使柱上只留下专一吸附的目的物。然后改变缓冲液,要求选择能减弱纯化目的物与亲和吸附剂之间吸附力的条件,使络合物解离洗出,图谱上出现第二个峰。一般洗脱方法是改变缓冲液的pH,改变离子强度或同时改变两者。洗脱蛋白质大多数用0.1mol/L稀醋酸或0.01mol/L稀盐酸,如果目的物会被酸破坏,可使用0.1mol/L氢氧化铵洗脱。蛋白质洗出后应立刻中和、稀释透析、重折叠为天然结构恢复蛋白质活性。

      除改变缓冲液pH作为洗脱方法以外,尚有用可溶性配基作竞争性洗脱。例如用较高浓度的抑制剂、辅酶或底物,竞争洗脱酶。用各种糖或低聚糖苷从固定化的植物凝集素亲和吸附系统上洗脱专一吸附的糖蛋白目的物。用这类洗脱剂的优点还在于它又一次地利用了生物专一性。但这种洗脱方法所得蛋白质溶液往往较稀,并含有可溶性洗脱剂,这可以用透析和凝胶过滤法除去。有些抗原和抗体结合力特别强,上述方法有时尚不能洗脱则可试用盐酸胍、尿素等蛋白促溶剂作为洗脱剂,洗脱的蛋白在适当处理后能恢复活力者才适用。当分离目的物洗脱下来后可连续使用大量洗脱液洗涤亲和柱,再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡,经过这样处理,亲和柱就可以重复使用。

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