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HEK293细胞系表达蛋白的实验步骤

 更新时间:2024-04-24 点击量:113

 HEK293细胞系作为常用的哺乳动物细胞系之一,被广泛用于表达外源蛋白的研究和生产。本文将详细介绍在HEK293细胞系中表达蛋白的方法步骤,包括细胞培养、转染、蛋白表达和纯化等关键步骤,并分享实验中的一些经验和技巧,以帮助读者更好地利用 HEK293细胞系开展蛋白表达研究。


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一、准备工作

在进行HEK293细胞系蛋白表达实验之前,需要进行准备工作:

1.确保培养皿、移液器、移液吸头、培养基、青霉素,离心管,水浴锅,CO2培养箱等实验设备及实验耗材和试剂齐全,并进行相关的灭菌处理。

2.HEK293细胞系的培养条件:HEK293细胞系通常在DMEM培养基中培养,含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。细胞应在37°C5% CO2的恒温培养箱中培养。

3.表达载体和目的基因:选择适合的表达载体(如pCMVpCMV-HA等)和目的基因,并进行构建和鉴定。

4.转染试剂:准备聚乙烯醇或脂质体lip2000等转染试剂。

二、HEK293细胞系细胞培养与扩增

HEK293细胞系的细胞培养与扩增过程中,关键的步骤包括准备工作、细胞解冻和传代、以及细胞培养条件的维护。下面将详细介绍这些步骤:

A.在进行HEK293细胞系的细胞培养与扩增之前,需要进行以下准备工作:

1. HEK293细胞系冻存管从液氮罐中取出,迅速放入37°C预热的水浴中解冻。

2. 准备DMEM培养基,添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。

B.细胞解冻和传代

1. 用预热的培养基尽快将解冻的HEK293细胞系转移至50 ml离心管中。

2. 离心约5分钟,去除上清液,用预热的培养基重新悬浮细胞。

3. 将细胞计数并等分至新的培养皿中,通常建议将细胞密度控制在70-80%的汇聚度。

4. 3-4天进行传代,避免细胞过度密集。

C. 细胞培养条件的维护

1. 将培养皿放入37°C5% CO2的恒温培养箱中,确保培养皿周围没有移动。

2. 每天观察细胞的生长情况,确保细胞呈现正常的形态和生长状态。

3. 定期更换培养基,通常每2-3天更换一次培养基,防止细胞过度饥饿或污染。

4.注意细胞的健康状态,如出现细胞凋亡、杂质等问题及时处理,以确保细胞的健康状态。

三、细胞转染

1. 细胞接种:将HEK293细胞系接种在培养皿中,使其达到70-80%的汇聚度。

2. 转染操作:将表达载体和目的基因与转染试剂混合,并在培养基中孵育形成转染复合物。

3. 转染处理:将转染复合物加入到细胞培养皿中,根据转染试剂的类型和实验需求,确定最佳的转染条件和时间。

细胞株-HEK293T

四、HEK293细胞的蛋白表达

细胞收集:

1. 转染48-72小时后,首先将细胞收集到离心管中,并用PBS(含有磷酸盐缓冲液)或生理盐水等无菌洗涤液冲洗细胞,将培养皿中残留的培养基和细胞碎片去除。

2. 为了获得总蛋白,需要对细胞进行裂解。裂解方法可以选择常用的RIPA裂解液或其他含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液,并在冰上或低温条件下处理,避免蛋白质降解。

蛋白表达检测:

1. 利用Western blot等方法对蛋白表达进行检测。首先,通过SDS-PAGE将裂解后的蛋白样品分离,然后将蛋白转移至膜上。

2. 对于Western blot检测,需要使用特异性的一抗和二抗来识别目标蛋白,并通过化学发光或荧光等方法来检测蛋白信号。

3. 根据实验需要,可以在不同时间点和条件下进行蛋白表达检测,以确定最佳的表达时间和条件。这可以通过调整转染剂的浓度、转染时间、蛋白表达载体的剂量等因素来实现。

在进行蛋白表达实验时,及时而准确地进行细胞收集和蛋白表达检测是非常重要的。通过合理的实验设计和技术操作,可以有效地评估目标蛋白的表达水平,为后续的功能研究提供可靠的数据支持。

组氨酸标签蛋白亲和纯化介质 Ni-IDA-Beads

五、蛋白纯化

1. 纯化方法选择:根据蛋白的理化性质选择合适的纯化方法,如亲和层析法纯化、离子交换层析或凝胶过滤等。

2. 纯化操作:根据选择的纯化方法依次进行样品处理、层析和收集。

3. 纯化效果评估:最终收集纯化后的蛋白样品,进行蛋白定量和功能分析,评估纯度和活性。

实验经验分享:

1. 实验设计:合理设置实验对照组,确保结果准确性和可靠性。

2. 细胞培养:注意细胞的培养条件和传代倍增,保持细胞处于健康状态和高表达效率。

3. 转染优化:密切注意细胞的转染效率,可尝试不同的转染试剂和条件来优化转染效果。

4. 蛋白表达时间点:选择适当的时间点进行蛋白表达检测,避免过度或不足表达。

5. 蛋白纯化杂质控制:在纯化过程中严格控制杂质干扰,确保蛋白的纯度和活性。

通过上述详细的方法步骤和经验分享,可以有效在HEK293细胞系中进行蛋白表达研究。

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