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悬浮细胞的电融合转染技术简介

 更新时间:2024-04-29 点击量:73

悬浮细胞的电融合转染技术
融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似,只是在进行高强度的电场脉冲前后,必须用低幅、高频电场使细胞排成一条链。
1 用融合介质(FM)洗悬浮细胞两次,然后悬于FM中。洗涤细胞时,在台式离心机上1000rpm下离心3分钟,得到细胞沉淀,弃去上清液将细胞悬于新鲜FM介质中。
2 将悬浮细胞转移到相应的融合室内。假如要使两种不同的细胞彼此融合,转移前要充分混合。
3 启动介电电泳场,其振幅通常小于200V/cm,频率在2MHz以内,用显微镜检测细胞是否排成一条链,调节振幅和频率以达到最佳效果。
4 让介电电泳场开约1分钟后关掉,立即应用融合脉冲,其振幅数量级为1kV/cm。脉冲宽度小于1ms。在进行融合脉冲后立即再次启动介电电泳场,常规让其开启约2分钟。
5 关掉介电电泳场,让细胞在样品池中静置10分钟。
6 去掉FM,用普通培养基再次洗涤细胞。
7 将细胞转移到培养皿,加入普通培养基,在培养箱一般条件下培养。

[注意事项]
1 适宜组分依使用的特定细胞种类而有变化。如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意,就应尝试改变穿孔介质。
2 影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关,为达到高效率,必须收集对数生长中期的细胞。
1.纯化siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素
抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。
 6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
7.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。


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