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琼脂糖凝胶电泳实验方法步骤

 更新时间:2024-04-30 点击量:131

琼脂糖凝胶电泳实验步骤:

(1)安装电泳管

选择聚含均匀、无气泡、无裂缝、胶面平整并与管壁没有脱离现象的合格凝胶电泳管 插入上电极槽底板的各圆孔中,留1/5在底板上方,保证使电泳管与底板垂直,密封处不 致渗漏。

(2) 加样

可利用上述方法制成样品胶,也可以用如下的一种方法加样。

将样品溶于200mg/ml浓度的蔗糖溶液中,或溶在10%甘油中,然后加在浓缩胶的 表面。

或将熔化的琼脂与样品溶液混合后加在浓缩胶表面。

或用与电泳管内径相近的圆形厚滤纸片,将样品溶液吸收后,紧贴在浓缩胶表面。 如样品是固体,应先溶在浓缩胶缓冲液中,并加入足够量lmol/L的蔗糖溶液,使样 品溶液的比重增大,再加在浓缩胶表面.

必须保证样品溶液具有低电导性,盐浓度不应超过0. 05mol/Lo

目前常用的加样方法是:用稀释5-10倍的浓缩胶缓冲液,使其成lmg/ml的浓 度,再加蔗糖使成浓度,然后在浓缩胶面上有电极缓冲液存在的情况下,用合 适的加样工具如微堇注射器,插入浓缩胶面与上方的电极缓冲液界面处,轻轻地将样品加 在浓缩胶面上.

(3) 加电泳缓冲液

样品加入后,在上下两个电泳槽中灌注电极缓冲液,缓冲液的温度需与电泳温度一 致。加入缓冲液时应小心操作,不能搅动电泳管中的样品溶液,并不使电泳管上下口留有 气泡。缓冲液的用垃随容器的大小而有异。一般情况下电极槽中的缓冲液量能使电泳管 至少有3/5浸入缓冲液为宜。

(4) 加指示染料

对于电泳系统常用的指示染料为0. 001%溴酚蓝,酸性系统常用的是0. 005%甲基绿 或甲烯蓝。用量为每500ml缓冲液加指示染料1mlD 一般加在上电泳槽缓冲液中。

天能水平电泳槽

(5) 琼脂糖凝胶电泳

在电泳槽上装配好电极,接通直流电源。碱性系统上电极接负极,酸性系统上电极接正极。

对于直径5〜7mm的凝胶,初2分钟用1mA/管的电流进行电泳,然后逐渐升高到 2〜5mA/管(10分钟)。通常5mm X 65mm的凝胶在20 C时用4mA/管进行电泳,大约需时40分钟。

在电泳过程中,常要求电流保持恒定。此时,电压会有升高。如果电流大而产生过高 的欧姆热,影响某些样品时,可以降低电流而延长电泳时间。

   电泳时间的长短与所用电流和凝胶的长度有关。为了节约时间也可以使用天能预制胶。但即使应用同样长度的凝胶,也会因凝胶系统和 样品性质的不同,而使电泳时间有差别。对于一般的 分析工作来说,如指示染料已迁移至距凝胶下端3〜 6mm,就可停止电泳,切断电源,取出电泳管。电极缓冲液可重复使用若干次,上下电极缓冲 液一般不要混合贮存,也不要将前一次的负极缓冲 液作下一次电泳时的正极缓冲液。因为经电泳后,二 电极的缓冲液组成已有了变化。

电泳

 有时候,我们需要进行长时间的电泳。例如:DNA的分离有时长达10余小时。为了防 止由于电极反应使缓冲能力耗尽从而引起pH的变化影响分离,1977年美国匹兹堡大学 T.G. Cooper提出用循环缓冲液的办法来保持缓冲能力不致耗尽,以达到缓冲溶液能较 长期使用的目的。

上下两个电泳槽的缓冲溶液水平保持恒定,但又没有建立通路。下槽的缓冲液可靠输 液器一滴一滴地滴入上槽。而当上槽的缓冲液增加时,就会经溢流管滴回到下槽,使上下 两槽的缓冲液水平在电泳过程中始终保持恒定。要注意的是,滴入上槽中的缓冲液,必须 不是线状连续的。 


预制胶800

琼脂糖凝胶的取出

电泳结束取出电泳管。然后,用配有细长针头并盛有水的注射器,将针头小心地插入 凝胶和玻璃管壁之间,边插入转动管子同时压进一些水,另一端也作同样处理。然后,将管F套上橡皮管用自来水压力压出凝胶,或用洗耳球压岀凝胶。如果压岀凝胶困难时,注射 器内可装甘油代替水压入凝胶和管壁之间。也可以用一根金属细丝,从凝胶和管壁之间穿 过整个玻璃管,然后,拉紧金属细丝转动玻璃管一周,就能使凝胶脱离管壁,再用洗耳球挤 压,就很容易压出。

也可以将电泳管浸入甲醇中,使凝胶收缩与管壁脱离而取岀,或根据具体条件用别的 办法取出凝胶。但必须注意,无论用何种办法,必须不损伤胶面。特别是浓度低的大孔凝 胶,机械强度差,取岀时应格外小心。