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使用荧光定量PCR仪时如何优化qPCR实验操作和数据分析

 更新时间:2024-07-10 点击量:60

实时荧光定量PCRqPCR)技术作为分子生物学领域中重要的实验室仪器,已广泛应用于各类生物学研究。然而,由于操作不当,许多研究人员在实验中遇到了数据精度不高、重复性差、可信度差等问题。本文针对这些问题,从引物操作技巧、反应体系配制技巧、阴性对照技巧以及结果分析技巧四个方面,详细介绍了使用荧光定量PCR仪时如何优化qPCR实验操作和数据分析,以提高实验结果的准确性和可靠性。

PCR优化

一、引物的操作技巧

使用荧光定量PCR仪在进行qPCR实验时,引物的设计至关重要。使用引物设计软件进行设计时,需在操作界面上设定相应的参数,扩增子参数一般设定范围为80200bp。扩增子长度越短,扩增效率越高,可选择设定在110bp。引物一般由试剂公司合成,为干粉状态,在溶解前,最好用高速离心机低温快速离心30s,使得引物干粉汇聚到管底,避免损失引物。收到引物后,需要先摸索引物的退火温度和终浓度,以达到较理想的qPCR扩增效果,其次测定引物的扩增效率。

二、反应体系配制技巧

正式实验时,每个样本至少3个重复,为了消除各重复之间的系统误差,将所需的所有试剂和模板加在同一个PCR管中,充分涡旋混匀后,再分装到3个重复孔中,这样可有效减小系统误差。另外,建议使用20μL以上的反应体积,以消除由于加样不准造成的系统误差。

三、阴性对照的技巧

   阴性对照一般是指用水代替模板的反应孔,体系中除了模板,包括了其他的反应组分。由于qPCR的高灵敏性,阴性对照有出现扩增信号的情况,那么在针对这类问题时,我们需要判断其原因所在。使用染料法进行qPCR实验时,首先查看阴性对照的溶解曲线主峰是否跟阳性孔的主峰位置一致。如果不一致,则可能是引物性能不好,无模板或使用低浓度模板下会出现引物二聚体,这种情况则需要考虑更换引物,保证引物特异性以及扩增效率。


Q2000A


四、结果分析的技巧

使用荧光定量PCR仪进行相对定量分析时,常用到的是2-ΔΔCq法,但是这种方法比较粗放,因为它的前提是假定所有引物的扩增效率都为100%。更为准确的定量则需要考虑不同引物扩增效率的差别。可先用梯度稀释的模板测试各引物的扩增效率E,获得实际扩增效率之后,后续实验只需要在软件中直接输入扩增效率E值,即可计算更精准的相对定量值。

通过对qPCR技术中引物操作技巧、反应体系配制技巧、阴性对照技巧以及结果分析技巧的优化,可以在很大程度上提高实验结果的准确性和可靠性。

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