聚合酶链式反应(PCR)是一种在生物分子领域中广泛应用的分子生物学技术。Taq DNA聚合酶作为PCR反应中的关键酶,其性能直接影响着实验结果的准确性和可靠性。本文主要介绍了Taq DNA聚合酶的来源、特性、活性定义及质量控制方法,并探讨了Taq DNA聚合酶在PCR反应中的使用方法及优化策略。
一、Taq DNA聚合酶的来源与特性
Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的耐热性DNA聚合酶,通过大肠杆菌重组表达纯化获得。该酶分子量为94kDa,与天然Taq DNA聚合酶具有相同的功能。Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性,但无3'→5'外切酶活性。这使得PCR产物的3'端带有突出的A碱基,便于克隆至T载体。
二、Taq DNA聚合酶的活性定义及质量控制
1. 活性定义:1个活性单位(U)定义为在74℃下,30分钟内催化10 nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量。
2. 质量控制:Taq DNA聚合酶的蛋白纯度通过SDS-PAGE凝胶电泳检测,纯度不低于95%。此外,还需进行以下检测:
(1)核酸内切酶活性检测:将5 U Taq DNA Polymerase与200 ng超螺旋质粒DNA在37℃下共同温育4小时,使用琼脂糖凝胶电泳检测,少于10%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。
(2)非特异性核酸酶活性检测:将5 U Taq DNA Polymerase与15 ng双链DNA片段在37℃温育16小时,使用琼脂糖凝胶电泳检测双链DNA底物无变化。
(3)宿主DNA残留检测:使用大肠杆菌16S rDNA特异性引物探针组,采用荧光定量PCR法检测5 U Taq DNA Polymerase,大肠杆菌宿主基因组DNA残留低于1 copy。
三、Taq DNA聚合酶在PCR反应中的使用方法及优化策略
1. 使用方法:
(1)建议的PCR反应体系:以50 μl体系为例,Taq DNA Polymerase(5 U/μl)0.25 μl,10×Taq Reaction Buffer 5 μl,dNTP(10 mM)1 μl,正向引物(10 μM)1 μl,反向引物(10 μM)1 μl,模板DNA x μl,ddH2O补至50 μl。
(2)常规PCR反应程序:预变性94℃ 3~5分钟,变性94℃ 30秒,退火55~65℃ 30秒,延伸72℃ 30~60秒/kb,终延伸72℃ 5分钟。
2. 优化策略:
(1)引物设计:引物长度建议设定为18~25 bp,GC含量为40%~60%。引物终浓度推荐为0.2 μM,效果不佳时可以在0.1~1 μM进行调整。
(2)模板浓度:不同模板最佳反应浓度有所不同。以基因组DNA为模板时,一般使用量应在10~400 ng;当模板为质粒或病毒DNA时,一般使用量应在10 pg~20 ng。
(3)预变性条件:对于一些复杂模板,如菌液、菌落(尤其是酵母)的PCR扩增,预变性时间可适当延长至10分钟,以提高预变性效果。
(4)目的片段长度:使用酵母菌液作为PCR扩增模板时,建议目的片段长度不超过2.5 kb;若超出2.5 kb,建议将酵母菌液预先进处理。
百时美的 Taq DNA Polymerase为来源于嗜热菌Thermus aquaticus,经大肠杆菌重组表达纯化获得的耐热性DNA聚合酶,分子量为 94 kDa,与天然Taq DNA 聚合酶具有相同的功能。该酶具有 5'→ 3' 聚 合酶活性和 5'→3' 外切酶活性,但无3'→ 5'外切酶活性。PCR 产物的3' 端带有突出的 A 碱基,可克隆至 T 载体。
总之,Taq DNA聚合酶在PCR技术中具有重要作用。通过了解其特性、活性定义及质量控制方法,合理优化PCR反应体系及程序,可以提高实验结果的准确性和可靠性。在实际应用中,根据不同实验需求,对Taq DNA聚合酶进行优化,有助于提高PCR技术的应用效果。
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