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PCR 反应体系与反应条件是什么?

 更新时间:2024-09-24 点击量:431

聚合酶链式反应(PCR)作为一种强大的分子生物学技术,在生命科学研究、医学研究、法医学等众多领域都发挥着至关重要的作用。深入了解 PCR 反应体系与反应条件,对于准确、高效地进行实验 非常重要。


PCR流程图

一、标准的 PCR 反应体系

标准的 PCR 反应体系包含多个关键成分。主要有:

10×扩增缓冲液,它为反应提供稳定的化学环境。种 dNTP 混合物,即脱氧核糖核苷三磷酸(包括 dATPdCTPdGTPdTTP),各以 200umol/L 的浓度存在于体系中,为 DNA 合成提供原料。引物是 PCR 特异性反应的关键,各 10100pmol 的引物决定了扩增的起始位置和方向。模板 DNA 的量通常在 0.12ug 之间,它是待扩增的目标 DNA 片段。Taq DNA 聚合酶以 2.5u 的量参与反应,催化 DNA 合成。Mg2+浓度为 1.5mmol/L,它对 PCR 反应的特异性和产量有显著影响。最后,通过加入双或三蒸水将反应体系调整至 100ul

二、PCR 反应五要素

PCR 反应主要由五种物质组成,即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+

引物是决定 PCR 特异性的关键因素。其长度通常在 15 - 30bp 之间,20bp 左右较为常用。合适的引物长度有助于确保特异性结合和高效扩增。引物扩增跨度以 200 - 500bp 为宜,这样可以在保证特异性的同时,实现对目标片段的有效扩增。引物碱基中 G + C 含量以 40 - 60%为宜,ATGC 最好随机分布,避免出现连续的 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列,以减少非特异性结合的风险。同时,要避免引物内部出现二级结构以及两条引物间互补,防止形成引物二聚体。引物 3`端的碱基应严格要求配对,否则可能导致 PCR 失败。

此外,引物中有或能加上合适的酶切位点,对于后续的酶切分析或分子克隆非常有好处。并且引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,以确保特异性。引物浓度也需谨慎控制,以低引物量产生所需要的结果为好,浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,还会增加引物之间形成二聚体的机会。

酶在 PCR 反应中起着核心作用。目前主要有两种 Taq DNA 聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP 即脱氧核糖核苷三磷酸,在 PCR 反应中为 DNA 合成提供原料。dNTP 粉呈颗粒状,保存不当易变性失去生物学活性。应配成高浓度后,以 1M NaOH 或 1M Tris.HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5,小量分装,-20℃冰冻保存。在 PCR 反应中,dNTP 应为 50200umol/L,并且 种 dNTP 的浓度要相等,任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低会降低 PCR 产物的产量,而浓度过高又会与 Mg2+结合使游离的 Mg2+浓度降低。

模板 DNA 是 PCR 反应的目标。传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 来消化处理标本,提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。对于一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 法,同时要特别注意防止 RNase 降解 RNA

 

Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有较大影响。在一般的 PCR 反应中,各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时,Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增;浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。

三、PCR 反应条件设置

PCR 反应基于原理三步骤而设置变性 退火 延伸三个温度点。对于较短靶基因可采用二温度点法。

PCR仪反应步骤

变性是 PCR 反应的一步,其目的是使双链 DNA 解链为单链。变性温度一般为 93℃~94℃,时间为 1min。变性温度低,解链不全是导致 PCR 失败的最主要原因。但温度也不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。

退火是第2步,在这一步引物与模板发生结合。退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸,G+C 含量约 50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。退火温度可通过公式 Tm (解链温度)=4(G+C)2(A+T),复性温度=Tm -(510)来帮助选择合适的温度。在 Tm 值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 3060sec,足以使引物与模板之间相结合。


PCR荧光2


接下来是延伸,在 Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。延伸温度一般选择在 7075℃之间,常用温度为 72℃。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸时间可根据待扩增片段的长度而定,一般 1Kb 以内的 DNA 片段,延伸时间 1min 是足够的。34kb 的靶序列需 34min;扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

总之,准确理解和掌握 PCR 反应体系与反应条件,对于成功进行 PCR 实验至关重要。只有在合适的反应体系和条件下,才能实现高效、特异性的 DNA 扩增,为后续的研究和应用提供可靠的基础。   

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