细胞培养是一项需要严格无菌操作的实验技术,以下是关于细胞培养的无菌操作基本技术、实验用品、培养基、抗生素和血清等方面的总结。
一、无菌操作基本技术
1. 实验前准备:
- 无菌室及无菌操作台以紫外灯照射 30 - 60 分钟灭菌,用 70% 乙醇擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风扇运转 10 分钟后开始实验操作。
- 每次操作只处理一株细胞株,不共享培养基,避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,用 70%乙醇擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转 10 分钟以上,再进行下一个细胞株操作。
2. 操作区域要求:
- 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品可暂时放置,其它实验用品用完即移出,以利于气流流通。
- 实验用品以 70%乙醇擦拭后带入无菌操作台,实验操作应在台面中央无菌区域,勿在边缘非无菌区域操作。
3. 取用物品注意事项:
- 小心取用无菌实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口,不在打开的容器正上方操作实验。
- 容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约 45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员安全:
- 工作人员应穿戴实验衣及手套后进行实验。对于来自人类或病毒感染的细胞株应特别小心操作,并选择适当等级的无菌操作台(至少 Class II)。
- 操作过程中,避免引起 aerosol 产生,小心毒性药品如 DMSO 及 TPA 等,避免尖锐针头伤害。
5. 定期检测项目:
- 检测 CO2 钢瓶的 CO2 压力。
- 检测 CO2 培养箱的 CO2 浓度、温度及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。
- 检测无菌操作台内的 airflow 压力,定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜、预滤网(300 小时/预滤网,3000 小时 /HEPA)。
6. 水槽处理:
- 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。
二、实验用品
1. 种类:
- 细胞培养实验用品均为无菌,除玻璃容器与 pasteur pipet 外,其它均为塑料无菌制品。
- TC 级培养盘表面有 coating 高分子物质以让细胞吸附,培养容器种类有 Tflask 、plates、dishes、roller bottle 等,依实验需要使用。
- 塑料无菌吸管:1 ml、2 ml、 5 ml、10 ml、25 ml。
- 塑料离心管:15 ml、50 ml,有两种不同材质, polypropylene(PP)为不透明材质,polystyrene( PS )为透明材质,可依实验需要选择。
- glass pastuer pipet:9 inch,用于抽掉废弃培养液等。
- 玻璃血清瓶:100 ml、250 ml、 500 ml、1000 ml。
2. 清洗:
- 新购玻璃血清瓶先以 0.1 - 0.05 N HCl 浸泡数小时,洗净后使用。
- 用过的玻璃血清瓶,高压蒸汽灭菌,洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净,勿加清洁剂清洗。
3. 灭菌:
- 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖,高压蒸汽灭菌 121 oC,15 lb ,20 分钟,置于 oven 中烘干。
- 实验用玻璃 pasteur pipet 以干热灭菌 170 oC ,4 小时。
- 液体或固体废弃物可用 10% hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水)或蒸汽高压灭菌 121 oC ,15 lb,20 分钟处理。
三、培养基
1. 贮存与使用:
- 液体培养基贮存于 4 oC 冰箱,避免光照,实验进行前放在 37 oC 水槽中温热。
- 液体培养基(加血清)存放期为六个月,期间 glutamine 可能会分解,若细胞生长不佳,可添加适量 glutamine 。
2. 粉末培养基配制:
- 粉末培养基之配制体积为 900 ml,pH 为 7.2 - 7.4,须添加 10%血清。NaHCO3 为另外添加,应分别溶解粉末培养基及 NaHCO3 粉末后再混合,用 CO2 气体调整 pH。
- 材料包括纯水、粉末培养基、NaHCO3、电磁搅拌器、无菌血清瓶、无菌过滤膜、pH meter 、真空帮浦、CO2 气体等。
- 步骤为溶解粉末培养基、溶解 NaHCO3 粉末并通入 CO2 气体至饱和、混合两种溶液、调整 pH、过滤灭菌、分装并贮存于 4 oC,同时配制之培养基需作生长试验与污染测试。
3. 配制培养基之生长测试:
- 材料有 MDCK cell、6-well TC plate 、methanol、glacial acetic acid、10% Giemsa solution 。
- 步骤包括培养 MDCK cell、观察细胞群落生长、固定细胞、染色、计数群落数并比较,若新配制或新批号培养基对细胞生长不佳则丢弃。
四、抗生素
1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素,培养自 ATCC 引进之细胞株,培养基中不加抗生素;培养自其它实验室引进之细胞株,制作 token freeze 前培养基须添加抗生素,通过污染测试后大量培养时不加抗生素。
2. 寄送活细胞时,须将培养液充满整个 flask 时,则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml )。
3. 若要检测 mycoplasma,则培养基内不可添加 gentamicin,因 gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。
4. 去除细菌污染之抗生素混合配方为 penicillin 250 units/ml,streptomycin 250 ug/ml ,neomycin 250 ug/ml,bacitracin 2.5 units/ml,注意混合使用后药物毒性会增强。
抗生素名称 | 工作浓度 | 储存温度 | 杀灭细菌类型 |
penicillin | 100 units/ml | -20℃ | G(+) bacteria |
streptomycin | 100 ug/ml | -20℃ | G(+) and G(-) bacteria |
chlotetracycline | 50 ug/ml | -20℃ | G(+) and G(-) bacteria |
gentamicin | 50 ug/ml | -20℃ | G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma |
amphotericin B | 2.5 ug/ml | -20℃ | yeast and molds |
nystatin | 50 ug/ml | -20℃ | yeast and molds |
fungizone | 2.5ug/ml | -20℃ | yeast and molds |
5. 表中列出了不同抗生素的使用种类、工作浓度、储存温度及杀灭细菌类型。
五、血清
1. 贮存要求:
- 血清必须贮存于–20 ~ -70 oC,若存放于 4℃,请勿超过一个月。
- 可将血清分装于无菌 50 ml 离心管中,预留血清结冻时体积增加约 10% 的空间,否则易发生污染或容器冻裂。
2. 处理方法:
- 一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。
3. 解冻步骤:
- 瓶装血清采用逐步解冻法,从–20 oC 或–70 oC 至 4 oC 冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,溶解过程中须规则摇晃均匀,勿直接由–20 oC 直接至 37 oC 解冻。
4. heat-inactivation:
- 指 56 oC,30 分钟加热已解冻之血清,目的是使血清中之补体成份去活化,除非必须,一般不建议作此热处理,会造成沉淀物增多且影响血清品质。
5. 注意事项:
- 勿将血清置于 37 oC 太久,否则血清会变得混浊,影响血清品质。
6. 血清之沉淀物:
- 凝絮物:由血清中之脂蛋白变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白造成,可用离心去除,或离心后上清液加入培养基中一起过滤,不建议用过滤步骤去除,以免阻塞过滤膜。
- 显微镜下观察之“小黑点":通常经过热处理的血清沉淀物会显著增多,这些小黑点一般不会影响细胞生长,但若怀疑血清品质,应立即停用,更换另一批号血清。
7. 血清之生长测试:
- 材料有 MDCK cell、a-MEM、 6-well TC plate、methanol、glacial acetic acid 、 10% Giemsa solution。
- 步骤包括培养 MDCK cell 至 80% confluency 、处理细胞制成悬浮液并测浓度、接种细胞入 6-well plate 并加入不同浓度血清的 a-MEM、培养、固定、染色、计数群落数、计算 SPE 和 RPE,比较各浓度血清培养基之 RPE,可知待测血清对细胞生长的影响。同时,可订购多量同一批号的优良血清,置于– 70 oC 保存。
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