cDNA合成技术:从原理到操作流程的全面指南

cDNA合成是分子生物学实验中的基础技术，它将RNA逆转录为互补DNA，广泛应用于基因克隆、表达分析等领域。本文将详细介绍cDNA合成的原理、方法及操作流程，帮助研究人员掌握这一关键技术。

cDNA合成的基本原理

cDNA即互补DNA，是指以信使RNA为模板，在逆转录酶作用下合成的DNA链。cDNA合成包括第一链合成和第二链合成两个关键步骤。

第一链合成

第一链合成使用逆转录酶，以RNA为模板合成互补DNA链。常用的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶，其中M-MLV逆转录酶的RNase H缺失突变株能合成更长的cDNA。

引物选择是关键环节，主要分为三类：

Oligo(dT)引物：特异性结合mRNA的poly(A)尾，对mRNA有高度特异性

随机六聚体引物：适用于所有RNA模板，尤其适合含有使反转录酶终止序列的mRNA

序列特异性引物：仅产生目标cDNA，导致更特异的PCR扩增

第二链合成

第二链合成主要有两种方法：

自身引导法：合成的单链cDNA 3'端形成发夹结构，作为合成第二链的引物。但该方法不易控制，且用S1核酸酶切割发夹结构时易导致mRNA 5'端序列缺失和重排。

置换合成法：利用RNase H在DNA-RNA杂交链的mRNA上造成切口和缺口，产生RNA引物，再在大肠杆菌DNA聚合酶I作用下合成第二链。该方法非常有效，可直接利用第一链反应产物，无需进一步处理和纯化，且不必使用S1核酸酶。

Riboclone M-MLV(H-) cDNA合成技术详解

系统组成

该系统的试剂包括：

特异性引物

M-MLV第一链缓冲液(5×)

rRNasin RNA酶抑制剂

M-MLV反转录酶，RNase H-

对照RNA

M-MLV第二链缓冲液(10×)

RNase H

DNA聚合酶Ⅰ

T4 DNA聚合酶Ⅰ

不含核酸酶的水

操作步骤

第一链合成

在无菌无RNA酶的离心管中加入RNA模板和适当引物（每μg RNA使用0.5μg引物），用H₂O调整体积至15μl。

70℃处理5分钟，冷却至室温，离心。

依次加入5×第一链缓冲液5μl、rRNasin RNA酶抑制剂25U、M-MLV(H-)反转录酶200U，用H₂O调至总体积25μl。

轻轻混匀，取出5μl至另一管中加入[α-³²P] dCTP，用于同位素掺入放射性活性测定。

37℃（随机引物）或42℃（其他引物）温浴1小时。

第二链合成

取第一链反应液20μl，依次加入10×第二链缓冲液20μl、DNA聚合酶Ⅰ23U、RNase H 0.8U，加H₂O至终体积100μl。

轻轻混匀，如需进行第二链同位素掺入测定，可取出10μl加入[α-³²P] dCTP。

14℃温浴2小时（如需合成长于3kb的cDNA，则需延长至3-4小时）。

70℃处理10分钟，低速离心后置冰上。

加入2U T4 DNA聚合酶，37℃温浴10分钟。

加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。

用等体积酚:氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后溶于TE缓冲液。

合成产物定量分析

通过同位素掺入放射性活性测定，可以计算cDNA合成量：

第一链产量测定：

第一链掺入率(%) = 掺入cpm/总cpm × 100%

掺入dNTP量(nmol) = 2 nmol dNTP/μl × 反应体积(μl) × 第一链掺入率

合成cDNA量(ng) = 掺入dNTP (nmol) × 330 ng/nmol

mRNA向cDNA转变率 = 合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng) × 100%

第二链产量计算：

第二链掺入率 = 掺入放射性活性/总放射性活性

掺入dNTP量(nmol) = [0.4 nmol dNTP/μl × 反应体积(μl) - 第一链掺入nmol] × 第二链掺入率

第二链cDNA合成量(ng) = nmol dNTP × 330 ng/nmol

双链cDNA转变率 = 双链cDNA合成量(ng) / 单链cDNA合成量(ng)

一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。

cDNA合成技术的创新进展

新型DNA合成技术

近年来，DNA合成技术不断创新。华大生命科学研究院研发的基于并行原理的DNA合成技术（mMPS）采用"微芯片"创新范式，在合成通量、产量和质量上实现了系统性突破。该技术将芯片分为独立的毫米级微芯片，每个微芯片上仅合成一条短链DNA，且表面带有专属识别码，可对DNA片段进行身份识别与分选。

环状RNA合成技术

国家卫生研究院开发出一种新型环状RNA合成法，利用连接酶核酶将线性RNA环化，生成环状RNA。这种环状RNA具有较高的稳定性，对核酸外切酶的降解有更强的抵抗力，明显延长了RNA的作用时间，同时降低了RNA的使用剂量。

AI技术在DNA设计中的应用

科学家们现在利用生成式人工智能设计合成DNA序列，作为"基因开关"控制哺乳动物特定细胞中的基因表达。这种技术可根据特定需求，从零开始"创作"自然界中不存在的DNA片段，为基因治疗提供了新的工具。

cDNA合成注意事项

RNA模板质量：RNA的完整性对cDNA合成至关重要。需使用高质量的无降解RNA，可通过琼脂糖凝胶电泳检测28S/18S rRNA条带比例（比值≥1.5）评估RNA完整性。

RNase污染控制：在整个实验过程中需使用无RNase污染的试剂和耗材，通常在合成第一链反应体系中加入RNA酶抑制剂以抑制RNA酶活性。

引物选择：根据实验需求选择合适的引物。Oligo(dT)引物对mRNA有特异性，随机引物适用于全转录组分析，序列特异性引物则用于特定基因的cDNA合成。

温度条件：逆转录温度对结果有显著影响。使用随机引物时通常在37℃进行反应，而使用其他引物时可在42℃进行。

应用领域

cDNA合成技术在多个领域有广泛应用：

基因表达分析：通过逆转录实时荧光定量PCR分析特定基因的表达水平。

病毒检测：在临床诊断中，cDNA合成是检测RNA病毒（如新冠病毒）的关键步骤。

cDNA文库构建：用于研究细胞或组织在特定状态下的基因表达谱。

基因克隆：克隆真核生物基因在原核系统中表达。

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