大鼠骨骼肌细胞培养技术指南-从原代取材到分化鉴定

骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。

    肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。

一、实验前准备

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

按照含 0.2%的 XI 胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的 PES 微孔滤膜进行过滤除菌，置于 50 毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。

取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量 PBS 置于相应标记的培养皿中。

无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD 大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

二、骨骼肌提取

眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有 PBS 的无菌培养皿中。

吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。

将剪取的骨骼肌在无菌 PBS 浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成 1 平方毫米不规则碎片。

轻轻摇匀，室温静置消化 30 分钟

收集组织悬液于 50 毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。

轻轻吹打混匀组织块悬浮液.

配平离心：使用低速离心机每分钟 1000 转，室温离心十分钟。

三、骨骼肌悬液制备及培养

离心后小心去除上清，不要吸到底部的组织块沉淀，用含 20%胎牛血清的 DMEM 培养基重悬，轻轻吹打混匀，制成悬液。

均匀转移至六孔板中，轻轻摇匀，标记时间后放于 37 ℃、体积分数为 5%的CO2 饱和湿度培养箱中培养。

本次实验采用差速贴壁法去除成纤维细胞,37 ℃培养 1 小时 后，吸取上清液置于另一孔中继续培养。

每隔一小时转移一次，转移 3-4 次。4 天后换液, 以后每天换液 1 次，直到增殖达到融合。

四、细胞观察及鉴定

差速培养后，细胞 24 小时后开始贴壁,96 小时后贴壁，倒置显微镜下每天观察细胞生长及形态特征，传代培养纯化至 P3 代用于后续试验。

采用 HE 染色和a-actin 染色进行骨骼肌细胞鉴定。

结果表明：本实验所用的消化液以及差速贴壁法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨骼肌细胞。

五、注意事项

1、消化液的制备及消化时间

合适的消化液以及消化时间的把握, 是实验取材的关键：

合适的消化液利于骨骼肌细胞从基膜中释放出来。

酶作用时间不足则获得细胞较少,作用时间过长则可致细胞受损、生长状态不佳。

2、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织：

肌肉组织表明的膜和脂肪组织去除利于后续细胞的纯化，减少传代次数，获得纯度高的骨骼肌细胞。

3、纤维细胞的去除 :

本实验采用差速贴壁法去除成纤维细胞,37 ℃培养 1 小时后移至另一孔进行培养。

转移两次，有效去除骨骼肌细胞中的成纤维细胞。

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