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关于SDS-PAGE凝胶电泳的常见问答

 发布时间:2022-04-08 点击量:548

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电泳


SDS-PAGE的工作原理是什么?

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N'-亚-CH3双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵(AP)和N,N,N',N'-四-CH3乙二胺(TEMED)的作用下组成。它是一种具有三维网络结构的凝胶。PAGE可以根据蛋白质分子的电荷和分子量不同而引起的迁移率不同,将蛋白质分成若干条带。SDS是一种阴离子表面活性剂,它可以在还原剂DTT存在下破坏蛋白质的氢键和疏水键,并与蛋白质分子按一定比例结合形成短棒状复合物。相同的密度,与蛋白质的分子量呈正相关,不同分子量的蛋白质所形成的复合物的长度是不同的。SDS使带负电荷的蛋白质的数量远远超过其原始电荷,掩盖了各种蛋白质分子之间的天然电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS复合物在电泳过程中的迁移率不再受原有电荷和分子形状的影响,而只取决于相对分子质量。


聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶通常由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。上下凝胶的区别在于丙烯酰胺的浓度和 Tris-HCl 的 pH 值。在电泳过程中,向凝胶施加电场,带负电的蛋白质从负极迁移到正极。最常见的电泳缓冲液由 Tris 和甘氨酸组成。浓缩胶中的 pH 值为 6.8,只有少数甘氨酸分子解离。因此,经 SDS 处理的蛋白质分子在上层甘氨酸分子和下层 Cl- 离子之间移动。这个过程将凝胶中的蛋白质样品压缩成比最初加载的体积小得多的条带。随着电泳的进行,蛋白质移动到分离凝胶(pH 8.8),甘氨酸分子在此解离,随着运动速度增加而超过蛋白质。所以,在分离凝胶中,每种蛋白质的移动速度取决于其分子量。分子量小的蛋白质可以较容易地通过凝胶中的孔,而分子量大的蛋白质则更难通过。一段时间后,蛋白质根据大小到达不同的距离,达到蛋白质分离的目的。

图 1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图


如何通过 SDS-PAGE 确定蛋白质的分子量?

SDS-PAGE是测定未知蛋白质分子量的主要方法。同时对分子量已知的蛋白质和未知样品进行电泳。染色后,根据标准蛋白的相对迁移率和分子量的对数,得到一条线,利用其相对迁移率确定未知样品的分子量。在实验室中,用一种与染料共价偶联的标准分子量蛋白质作为参考蛋白质,粗略地指示未知蛋白质的大小。这种预染色的蛋白质标记可以在电泳期间或转移膜时直接观察到。


如何读取 SDS-PAGE 结果?

电泳后,肉眼无法直接观察到蛋白质分离,需要后续的染色技术。考马斯亮蓝染色和银染是常规检测和定量电泳分离蛋白质的常用方法。经过固定-染色-脱色等简单处理后,可以清楚地观察到蛋白质的分布。随着高灵敏度蛋白质分析方法和蛋白质鉴定技术的改进,荧光标记、同位素标记技术等新型染色方法的灵敏度大大提高,同时也兼容自动化蛋白质组平台凝胶切割技术。开发了较高灵敏度和自动化的染色技术。


如何储存 SDS-PAGE 凝胶?

通常在每次实验之前准备新鲜的 SDS-PAGE 凝胶。然而,凝胶也可以在 4°C 的清水中储存约一周。如果凝胶染色后不能及时拍照,则需要将其放入水中,以防止凝胶干燥和收缩。建议尽快拍摄染色结果。如果凝胶长时间浸泡在水中,条带会散开。


如何实现快速电泳?

探究电泳实验过程你会发现,其实凝胶电泳步骤中,配制 SDS-PAGE 凝胶是一个重要的环节,同时也是花费时间较多的一步。那么有没有什么办法可以加速这一过程呢?其实,市场已经在推出预制胶,这种SDS-PAGE 凝胶是已经配制好的,无需经过繁琐的制胶流程,拆了包装就可以直接使用的。上海天能 Precast Gel预制胶不仅仅使电泳实验的时间缩短了30%,而且这种预制胶还采用了新型缓冲液配制技术,使电泳条带清晰而均匀,有效避免了SDS水解或PH值不稳定所造成的凝胶性能不稳定,条带不均匀等缺陷。

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