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荧光定量PCR出现CT值异常怎么办?

 发布时间:2022-05-05 点击量:804

荧光定量PCR是生物医学中常用的检测核酸病毒的方法之一,由此,这几年PCR 仪也成了近几年临床检测和分子生物学研究的重要实验室设备。 我们知道CT值是PCR 扩增曲线中的重要参数,那么CT值是什么?它与 PCR扩增存在什么关系?为什么有的时候基因扩增实验中会出现 CT 值异常甚至缺少CT值的情况?

什么是CT值?

荧光定量PCR扩增实验中,当扩增产物的荧光信号(Fluorescence signal)达到设定的荧光阈值(FLUORESCENCE threshold)时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。也可以理解为在qPCR实验过程中初始模板扩增到一定产物量值时,所对应的循环数。 CT 值的表达公式为:扩增产物量=起始模板量×( 1+En)循环个数。


通常QPCR实验中CT值的异常主要有以下几种情况:

 一、扩增曲线正常,CT值偏大或偏小

从CT值表达公式中我们可以看出初始模板的质量和扩增效率,会直接影响到CT值的大小。 如果扩增起始模板量浓度高或引物设计不合适那么所用的循环数就会小,即出现Ct值过小;反之,起始模板量浓度过低,Ct值会偏大。 PCR扩增效率与 CT 值也是成反比关系,扩增效率高则CT值小,扩增效率低则需要要用到的循环数增加所对应的CT值也会偏高。另外,合理的引物设计,防污染试剂的应用也会影响到CT值的大小。

二、 有扩增曲线,但却没有CT值,CT值显示状态为Undetermined

这种情况下你通常也会发现由于阀值位置不正常正常导致荧光阈值线与扩增曲线没有交点,所以仪器显示状态为Undetermined。出现这种如果扩增模板浓度是正常的,那么多数原因可能是由于系统界面参数设置错误所导致的。如果参与扩增的模板并非所有的孔,而系统界面在所有的 ( C-H行)都默认 设上了target和 sample 参与CT值计算。这个时候系统会默认所有孔参与荧光定量 PCR 实验 。导致CT值错误。如果我们把无样品C-H 行 数的target和sample 前面的“√" 清除 后重新分析计算,就会得到正常的荧光阈值线 C T 值了。

三、 有扩增曲线,阈值线的位置也正常,但大多数孔仍然不显示CT值。

当系统界面C-H行 显示出现异常提示(比如黄色三角形标示),在数据分析中会再很多孔内出现 BLFAIL提醒。这表明基线分析失败,如果确定我们在反应物中加了荧光染料,如果加了,那么这种 荧光值偏低现象,可能由于使用了透光性不好PCR 耗材或不配套的耗材所导致。这种情况较容易出现在底部或侧边扫描检测的PCR 仪器中;朗基的 Q2000系列采用的顶部CCD 实时检测技术甚至可以用完全不透明的白管进行实验,所以一般不会存在这种问题。

四、 还有一种情况较为常见也就是扩增曲线不正常,CT值都显示“Undetermined"。 

此时,如果在荧光定量PCR检测报告页面出现了ROX的荧光值 为0的情况,很可能是使用了不含ROX 试剂而系统参数中未做修改所造成,及时在分析设置中将 Passive reference dye的ROX 改成None,再重新分析即可正常显示。有些没有ROX 校正的PCR 仪中也较容易出现此类问题。 
从上面Qpcr实验中常几种常遇到的几种情况中可以看出:要想获得 准确的pcr实验结果,实验的设计及样本、配套试剂耗材、仪器类型的选择、正确的软件操作等都与实验本身密不可分。

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