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蛋白质免疫印迹实验中条带过多怎么办?

 发布时间:2022-06-16 点击量:134

标签:免疫印迹 蛋白质 科普 抗体  蛋白质免疫印迹
    蛋白质免疫印迹是检测复杂混合物中蛋白质抗原的常用技术。通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品,然后将分离的蛋白质转移到膜上。这些膜与特定于目标蛋白质的抗体一起孵育,该抗体与固定在膜上的蛋白质条带结合。然后使用检测系统对抗体进行可视化,该系统通常基于与 Ig 链结合的二级蛋白质,该蛋白质与显色反应相关。
与理论预测相反,检测到几个波段的情况并不少见。虽然抗体可能并不完全针对蛋白质,但其他因素可能是原因:

1. 抗原的蛋白水解分解。
这种情况并不少见,特别是如果样品储存时间过长,或者在起始组织均质化后分离蛋白质或膜。所有附加条带的表观分子量均低于全长蛋白质。特别易感的是突触蛋白和突触结合蛋白。应考虑添加蛋白酶抑制剂,如 PMSF、胃蛋白酶抑制剂或亮抑酶肽。 
2. 每条泳道蛋白质过多或检测系统过于敏感。
蛋白质免疫印迹法中,凝胶过载是“鬼带"的常见原因之一。固定的蛋白质可以提供一个集中的吸附表面,某些 IgG 可以非特异性地结合到该表面。类似地,当使用高度灵敏的检测系统(例如增强的化学发光)时,可能会发现这种非特异性结合。起始材料的一系列稀释通常会澄清哪些信号是人为的。
3.低效阻塞。
实验中会应用到多种不同的封闭剂,某些非离子去污剂或蛋白质等封闭剂容易产生低效阻塞的影响。如果改变阻塞条件就可以解决此问题。
4. 抗原浓度过低。
SDS-PAGE 的分辨率一般限制在 50-100 个波段。如果抗原的相对浓度过低(小于总蛋白的 0.2%),则可能难以检测(例如,突触释放蛋白/VAMP 与细胞匀浆中的组蛋白共迁移,干扰其检测)。信号增强可能会导致人工带的出现。因此可以适当考虑通过分级分离或免疫沉淀富集抗原。
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