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CCK-8细胞活性检测实验步骤

 更新时间:2023-02-03 点击量:1565


CCK-8细胞活性检测实验步骤

  CCK-8实验可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测,也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测,或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。使用酶标仪在450nm波长处测OD值,可间接性反应活细胞的数量。使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测是一种高灵敏度,无放射性的比色检测法。
CCK-8细胞活性检测实验步骤:
一、实验前准备:
酒精灯、移液枪、酶标仪(带有450nm滤光片)、96孔培养板、CO2培养箱、CCK-8、细胞计数板、PBS等。
二、绘制曲线
1.制备细胞悬液:选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液,并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) :按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做5-7个细胞浓度梯度(比如,稀释10倍,100倍......),每组4-6个复孔。
3.绘制标准曲线:接种后培养一定时间待细胞贴壁后,然后每100μL培养基加10μL(10%)CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD值为纵坐标的标准曲线。
根据此标准曲线可测定出未知样品在条件一致的前提下的细胞数。
标准曲线还有助于确定细胞接种的合适数量以及摸索CCK-8后所需孵育时间。
三、细胞增殖检测

1.制备细胞悬液:选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液,并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) :根据合适的铺板细胞数(根据自身的细胞类型而定,以一周能铺满为宜,若为血液细胞密度可适当增大),每孔接种约100ul细胞悬液,每组设置4-6个复孔。
①当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1000 个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2500 个/孔(100μl培养基)。悬浮细胞由于染色比较困难一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
②当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。为减少误差,最外一圈的孔只加100ul PBS、水或者培养液,不作为测定孔用。
③接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不一致。3.将培养板置于培养箱中预培养(37℃,5% CO2)12-24小时,使细胞达到指数期(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
4.每孔加入10ul CCK-8试剂
①由于每孔加入CCK-8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议直接配置含10% CCK-8培养基(现用现配)以换液的形式加入。注意加CCK-8试剂时不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数。加CCK-8试剂时速度要快,减少试剂在移液器上的残留,加入CCK-8试剂后轻轻震培养板。
②加CCK-8试剂时间可分别在22h、46h、70h、94h时加入,也可以在24h、48h、72h、96h时再加入。重要的是需保证实验组和对照组在同一时间点进行实验。
③若细胞培养时间较长,培养基颜色或 pH 发生变化,建议更换培养基后再加 CCK-8。5.将培养板置于培养箱内继续培养0.5-4小时①培养时间因孔中细胞的类型和数量而异,需要自己摸索,因为细胞种类不同,形成Formazan的量也不一样。
②如果显色太浅的话,可以将96孔板置于37℃细胞培养箱中继续培养,可参考标准曲线确定培养时间。
③一般情况下,白细胞着色较弱,因此可能需要较长的孵育时间(最多 4 h)或增加细胞数量。
④CCK-8 的反应时间以具体显色的适宜时间为准。可在0.5h、1.0h、2.0h分别观察培养基的颜色。最佳OD 值控制在1.0左右较合适。6.使用酶标仪检测450nm波长的吸光度(OD值)。实验重复3次,取实验结果的平均值作为最终实验结果。

空白对照的设定:在同体积的培养基中加入CCK-8,培养同样的时间,和实验组一起测定450nm的吸光度。
①使用酶标仪检测时记得打开96孔板盖子,需保证酶标板的表面以及板底是干净的,且每个待测孔内没有气泡,以免干扰实验结果。
②如果结果出现“overflw"则需降低细胞接种密度,如果因实验需要不能减少细胞数时可缩短加入CCK-8后的培养时间。
③如果样品为高浑浊的细胞悬液,建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。(CCK-8 在参比波长处没有吸光值,设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。)
④若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
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