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CCK-8法进行细胞毒性检测的方法

 更新时间:2023-02-03 点击量:969
CCK-8法进行细胞毒性检测的方法
CCK-8法是细胞活力和细胞毒性检测常用的一种检测方法,其具体操作方法如下:
1.制备细胞悬液:选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液,并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔)。
3.将培养板置于培养箱中预培养(37℃,5% CO2)12-24小时,使细胞达到指数期(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
4.吸出各孔培养基,向培养板加入10μL不同浓度的待测药物进行干预。(实验组加入含不同浓度药物的培养基,空白组加入不含药物培养基)
5.将培养板在培养箱(37℃,5% CO2)培养一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时,具体时间一般根据细胞周期来决定)。
6.每孔加入10ul CCK-8试剂。①在做加药实验时,还应考虑药物的吸收。如果实验中待测物质有氧化还原剂,在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较(只加CCK-8试剂),如果OD值明显偏高,则说明有反应。
②可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物对实验的影响。
③当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。5.将培养板置于培养箱内继续培养1-4小时:
6.使用酶标仪检测450nm波长的吸光度(OD值)按公式计算:
细胞活力(%)=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
细胞抑制率(%)=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验组吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液);
Ac: 对照组吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液,不含药物);
Ab: 空白组吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液,不含细胞、药物)。

 
CCK-8法进行细胞活力指细胞增殖活力或细胞毒性检测时的注意事项:
 
由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。
 
由于 CCK-8 分析基于活细胞中脱氢酶活性的检测,因此影响活细胞中脱氢酶活性的条件或化学物质可能会导致实际活细胞数与使用 CCK-8 分析确定的细胞数之间存在差异。
 
考虑到不同类型细胞代谢水平存在差异,有些细胞在药物处理后,可能活细胞数不变,但是有氧代谢能力降低后,NAD+产生减少,测出的Formazan也会减少。
 
CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。
 
在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。
 
金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会*抑制。
 
CCK-8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰,可以通过减去空白孔中本底的吸光度而消除。
 
混合或重悬组分时,避免产生气泡,因为它们会影响OD值读取。
 
刚开始做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
 
CCK-8反复冻融会增加背景值,干扰实验测定。
CCK8的说明书大家一定要认真阅读,里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值,因为那是反复验证过的最佳数值。
CCK-8法进行细胞毒性检测的优势:

1、使用方便,CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,可以直接加入到细胞样品中(悬浮和贴壁细胞均适用),不需要预配各种成分,不需要对细胞进行过多的处理,也不必添加放射性同位素、有机溶剂等,且能够快速进行检测;
2、CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;
3、CCK-8法的重复性优于MTT 法,MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的,需要使用DMSO 等有机溶剂溶解;
4、而本方法产生的formazan 是水溶性的,不仅省去了溶解步骤,更因此而减少了该操作步骤带来的误差;
5、CCK-8法对细胞毒性小,可以多次测定选取最佳测定时间,与MTT 方法相比线性范围更宽,灵敏度更高;
6、CCK-8 对细胞的毒性非常低,其他的实验,例如中性红法或结晶紫法 ,也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。
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