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实时荧光定量 PCR技术

 更新时间:2023-02-03 点击量:842

实时荧光定量 PCR,简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种,目前该技术已得
到广泛应用,如:扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP 分析等。荧
光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和
Taqman 水解探针的特异性方法。
 
SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波
长的荧光染料,可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。在游离状态下,
SYBR Green I 发出微弱的荧光,但一旦与双链 DNA 结合,嵌入至 dsDNA,荧
光大大增强。
因此,SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关,PCR 扩增
不同时期中,dsDNA 含量不同,SYBR Green I 荧光信号强度不同。可以根据荧
光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量,并可根据对照进行相关的计算
和分析。
实验前准备
实验开始前,需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括:特异性 PCR 引物,新鲜提取备用的总 RNA。
使用的试剂盒有:用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor First
Strand cDNA Synthesis Kit,包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关
的正对照反应组分。配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master,
包含了 PCR 所需的各种实验组分,如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase
及反应缓冲液,dNTP mix,SYBR Green I 染料和 MgCl2
正式试验开始前,冰上解冻各个试剂及试剂盒组分,置于冰上待用。注意:
SYBR Green I Master 需避光放置。
所需仪器与耗材有: LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配
套使用的 96 或 384 多孔板,透明封板膜等一次性耗材。朗基T30 PCR 仪、rainin单道移液器、Nunc 冰盒及NEST 盒装吸头等。
 
实验操作流程:
1.用新鲜提取的 RNA 反转 录合成 cDNA 第一链,然后进行实时荧光定量 PCR,其中包括:SYBR Green 反 应体系的配置;PCR 程序设置;运行 PCR 实验,样品编辑和结果分析。
2.反转录反应 :
反转录合成 cDNA 第一链实验操作时注意:所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套,防止 RNase 污染。
相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix,
总体系 13μl,本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行
的反转录。先配置 NTC 对照,加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引
物 1μl、5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl,混匀。然后进行样品一号管的体
系配置,依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、1μl oligo dT 引物、2μl 随机六聚体
引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl,混匀。其他样品管,参照 1 号管的配置
方法,依次加好反应体系。
注意:可将总RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg,mRNA调整至 1-100ng。
若 RNA 样品浓度较低,则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。
将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min,可有效减少 RNA 的二级
结构。加热后迅速置于冰上骤冷,放置 5min。
在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序,依次加入以下试剂:2 号管
的 5×反转录酶 buffer,4 号管 dNTP mix,3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂,1 号
管 20 U/μl 的反转录酶,最终体积为 20μl。
若样品数较多,先配置反应 mix 再分装,小心吸打混合,切勿涡旋振荡。混匀后于瞬时离心机上短暂离心,使样品和反应液落至离心管底部。
将离心管放置 PCR 中,根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程
序设置。本实验反应温度和时间设置为:25℃,10min,55℃反应 30min。反应完毕后,于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶,再置于冰上停止反应。
此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h,或在-15 至-25℃下存放更长时间。
3. Q-PCR 扩增
cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。20μl 的 PCR 反应体系
可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性,
可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版,减少其对后续 PCR 的影响。
本部分实验,我们选用 SYBR Green I Master 试剂盒进行定量分析。
本实验共设置 5 个标准样品,包含 1 个标记为 0 的空白对照,5 个反转录样
品,包含 NTC 对照,由于样品数较多,先配制不含模版的总体系,再分装为 10
管,加入各个样品的模板后,再将每个样品分装为 3 个复孔。
按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix,10x Primer 上下游引物,
PCR 级别水。总体系配好后,在用移液枪轻柔吸打均匀,然后分装为 10 管,每
管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。
STD 零加入 6μl 水代替模板,其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标
样模板。反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA,包含 NTC。混匀,
然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板,将多孔板
置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在 LightCycler® 480 设备中。
4.程序设定
双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆,自动进入软件界面,点击 new
experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检
测通道的设定,
接下来设置反应体积,对于 96 模块,反应体系为 10μl-100μl 之间,本实验
是设定 20μl 的反应体系。
在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation,预变性设定 1 个循环,
无需进行荧光的收集,执行的温度和时间设定为 95℃ 10min,视图会根据设定
进行实时的调整。点击增加按钮,输入 Amplification,定义扩增循环的次数为 45 次,并选择
荧光的收集功能 Quantification,然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10
s,点击增加按钮,设定退火温度和时间为 60℃ 10s,以上两步 Acquisition Mode
都默认选择 None,继续点击增加按钮,设置延伸温度和时间为 72℃ 20s,
Acquisition Mode 选择 Single,Ramp Rate 均按自动调整值,无需再设置。
设置溶解曲线,在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves,1 个循环
数,Analysis Mode 选择 Melting Curves,时间和温度设置为 95℃ 5s,点击增加
按钮,新增设置温度和时间为 65℃ 1min,以上两步 Acquisition Mode 都默认选
择 None。点击增加按钮,新增设置温度为 95℃,Acquisition Mode 选择 Continuous,,
其他设置无需改动。
设置保温的过程 Cooling,只需 1 个循环,无需收集荧光,设定温度和时间
为 40℃、1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR
的循环体系、温度的设置已经设定完毕。
点击 Start run 开始运行 PCR 反应,此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
5.样品编辑
实验结束,点击 Sample Editor,进入样本编辑区。
Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编
辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。
在 Select Sample 中,选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name
输入被选择样品组的名称,并在 Sample Type 中选择样品组的类型,最后点击
Make Replicates 设置复孔。标准品设置时,需填写拷贝数,只需填写好稀释倍数,
初始浓度即可。编辑好样品后,即可进行数据分析。如有需要,也可进行子集编
辑。
6.结果分析
样品编辑好后,可进行实验结果分析。
点击左边栏下方的 sum 按钮,相应出现实验的所有信息,包括:设计的反
应程序,实验结果分析等。
点击 analysis,可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。点击 Abs Quant second derivative max,弹出 create new analysis 窗口,在 Subset
选项中选择分析样品的分布区域,点击确定,即可出现分析图:相应样品的扩增
曲线。
Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线,曲线左侧标有扩增效率、斜
率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error"值越小,说明实验的准确率越高。
扩增效率如果越接近“2",说明这次的扩增反应越好。
在数据表格,可显示单个样本的 Cp 值,以及相应的样本浓度值。
按复孔进行数据统计,显示 Cp 平均值,方差,浓度的平均值以及方差。
苏州阿尔法生物提供的实时荧光定量PCR仪、高速离心机、恒温混匀仪、rainin移液器等试验设备及1.5ml离心管、pcr管、酶标板等实验耗材,广泛用于荧光定量PCR实验。