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荧光蛋白Marker优化方案

 更新时间:2023-02-09 点击量:462
荧光蛋白Marker优化方案
    有报道称一种自预染荧光蛋白Marker,能够实现蛋白Marker即是预染蛋白又是曝光蛋白。  具体原理是:将天然提取的荧光蛋白(包括藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等,其分子量为 20-300kDa),与能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG和能被二抗结合的抗体Fc区蛋白或肽共价偶联,由于荧光蛋白自带颜色,从而实现蛋白即是预染蛋白,又是荧光蛋白的目的,无需转膜染色或X光片成像,此外,荧光蛋白Marker条带可特异性结合一抗或者二抗,使蛋白样品和蛋白marker 经化学发光检测后,能够同时在X光片上显示出来。
     此方法的优点克服了预染蛋白Marker的化学修饰(染料属于有机化合物),只是将不同功能的蛋白或多肽偶联在一起(类似于融合蛋白),不会出现电泳迁移变化,蛋白分子量不准确的现象;也不会影响和膜的结合能力,能够很好的提示转膜情况;还能实现蛋白Marker与目标蛋白显示在同一张照片上。缺点是需要将天然提取的荧光蛋白经过复杂的化学反应偶联上识别抗体的蛋白或多肽才能实现共同曝光在一张照片上,此过程操作复杂繁琐,还会造成批间差异。

荧光蛋白Marker优化方案
   方案一:利用色素蛋白Marker代替预染Marker,此类蛋白包括含铁卟啉的色素蛋白质、含黄素的色素蛋白质和含胡萝卜素的色素蛋白质等。由于蛋白没有进行化学修饰,不会出现预染蛋白Marker因为经过化学修饰后在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变,分子量信息不再准确的现象,也不会影响和膜的结合能力,肉眼就可以观察转膜效率。曝光的时候,需要集普通扫描仪(类似照相机)和ECL扫描仪或者荧光扫描仪为一体的设备,先通过普通扫描仪将色素蛋白Marker成像,然后利用ECL扫描仪或者荧光扫描仪将目标蛋白成像,再利用软件将这两种照片整合在一起,由于是同一张膜,拍照未挪动位置,只是进行二次不同捕光原理成像,就不存在拼接导致位置错误,并且照片是由专业软件整合,不会出现修改和拼接痕迹。缺点是需要集普通扫描仪(类似照相机)和ECL扫描仪或者荧光扫描仪为一体的设备。
   方案二:利用荧光蛋白的颜色(带颜色的荧光蛋白,例如藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等,代替预染),肉眼就可以判断转膜效率。同色素蛋白一样,由于蛋白没有进行化学修饰,不会出现电泳迁移变化,蛋白分子量不准确的现象;也不会影响和膜的结合能力,能够很好的提示转膜情况。优点得到的荧光蛋白不需要进行预染处理就可以肉眼识别,也不需要进行改造去识别二抗,就可以荧光扫描。如果标记信号是荧光,仅仅使用荧光扫描仪就可以将Marker和目标蛋白显示在同一张张片上;如果使用ECL发光液,按道理也能用荧光扫描仪就可以将Marker和目标蛋白显示在同一张照片上,只是荧光蛋白需要激发后才可以产生荧光,而ECL发光属于化学发光,是通过化学反应产生荧光。
    方案三:将荧光蛋白(带颜色的荧光蛋白,例如藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等,代替预染)与识别抗体IgG的proteinA、proteinG或 ProteinL,以及能被二抗结合的兔源或鼠源抗体Fc区基因融合表达,由于荧光蛋白自带颜色,肉眼就可以判断转膜效率;同时,荧光蛋白 marker中的蛋白可以识别不同来源的一抗或二抗,能和目标蛋白一起曝光显示在一张照片上,实现了荧光蛋白Marker既是自预染蛋白(自带颜色)又是曝光蛋白。由于荧光蛋白Marker没有进行化学修饰,确保了蛋白分子量准确,也不会影响电泳迁移变化和与膜的吸附能力。此外,在进行Western检测时,不需要加入额外抗体试剂,也不需要使用集成多种检测器的特殊设备,实验室常规WB检测设备就可以胜任。
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