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什么是蛋白酶K,蛋白酶K的生产有哪些挑战?

 更新时间:2023-02-09 点击量:642

  蛋白酶 K(Proteinase K)是一种广谱丝氨酸蛋白酶,蛋白酶 K于1974年在fungus Engyodontium album的提取物中发现。能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)作为碳源和氮源的环境中生长,说明该酶可以消化角蛋白,因此被称为“蛋白酶 K"。蛋白酶K由一条肽链组成,含有277个氨基酸,该蛋白的相对分子量~28.9kDa,蛋白酶K是一种稳定且具有高活性的丝氨酸蛋白酶。晶体和分子结构研究证据表明该酶属于枯草素家族,具有活性位点催化三联体(Asp39-His69-Ser224)。蛋白酶K家族包含了各种由革兰氏阴性细菌、酵母及真菌分泌的细胞内肽酶。
    蛋白酶K具有非常稳定的蛋白结构、超高的蛋白水解活性以及广泛的底物特异性,偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链,能优先分解与含硫氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的羧基端连接的肽键。与其它的蛋白酶相比较,蛋白酶在一系列广泛的环境中均稳定:pH,缓冲盐,去污剂(SDS)以及温度。如:该酶的活力不会被尿素、SDS和EDTA等变性剂抑制,在高温、高盐或较高的pH等条件下,蛋白酶K仍能保持非常高活力。因该酶可以在较广的pH范围(4~12.5)内及高温(50~70℃)均有活性,在0.1-0.5% SDS存在的情况下,蛋白酶K可保持活性,在不损害分离DNA完整性的前提下,可以消化DNA制剂中的多种蛋白质和核酸酶。
蛋白酶K /国家标准:
《蛋白酶K》(GB/T 34793-2017)是2018年5月1日实施的一项中华人民共和国国家标准,归口于中国标准化研究院。《蛋白酶K》(GB/T 34793-2017)规定了蛋白酶K产品的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。《蛋白酶K》(GB/T 34793-2017)适用于生化试剂蛋白酶K产品的生产和检测。
蛋白酶K生产过程中的挑战:
①表达量低:由于蛋白酶K能够非特异性的降解大多数蛋白,因此在使用微生物表达生产该蛋白时,其表达的蛋白酶K可以对表达宿主中的有功能的蛋白进行水解,造成表达宿主不能持续的表达该蛋白,因此蛋白酶K的表达量很低。而筛选高表达量蛋白酶K的表达系统或菌株,需要花费大量的精力和较长的时间。
②不稳定性:虽然蛋白酶K可以在高温、高盐或较高的pH等苛刻的条件下保持很高的活性,但是该酶可以自己酶解自己,在无保护剂时,在37℃条件下很难长期稳定保存
该酶易沉淀:在制备蛋白酶K的冻干粉时,为了保证冻干粉中蛋白酶K的固含量维持在一个比较大的水平,通常需要在高浓度时加入冻干保护剂,然而在蛋白酶K浓度达到20mg/mL或者以上时,该酶很容易聚集形成沉淀,这给蛋白酶K的高固含量冻干造成了极大的挑战。
④生产投入大:在大规模发酵时,会产生大量色素和宿主核酸的残留,简单的纯化工艺很难除去这些杂质,而使用复杂的纯化工艺则会降低了回收率并且使生产成本加大。蛋白酶K具有很强的蛋白水解活性,能够将实验室或车间使用到的其它酶或蛋白水解,所以生产蛋白酶K需要专门的产地、仪器设备及配套设施。
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