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病毒纯化方法

 发布时间:2023-02-14 点击量:116

    病毒是一类非细胞型生物,需要寄生在其活细胞体内,虽然大部分病毒对人体是有害的,但是随着科学的发展,发现很多病毒有较高的利用价值。例如:可以作为基因工程载体的慢病毒、腺相关病毒等;还有噬菌体展示技术,可以帮助我们对蛋白质进行相关研究;以及曾作为细胞融合应用的仙台病毒;而病毒最重要的应用,就是用来制备灭活、减毒、亚单位疫苗。本期,我们主要对病毒疫苗生产过程中的纯化方法进行介绍。

 病毒提纯是病毒学研究的重要前提,病毒的相关详细研究都需要高纯度的病毒样品。病毒纯化是在病毒不受损、不失活的前提下使用一些物理或化学方法,去除宿主细胞杂质组分,提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒纯度只是一个相对的概念,我们通常会参考病毒的物理均一性、病毒滴度、蛋白含量比例和免疫学反应来判断病毒的纯度。

  在疫苗的制备中,需要先进的分离纯化技术和设备。经典的疫苗纯化常用离心、过滤、沉降、萃取等方法分离纯化,但随着对疫苗质量和安全有越来越高的要求,疫苗纯化进入了色谱时代,高性能的离子交换介质、疏水层析介质、亲和层析介质等可满足疫苗纯化的各种需求。

纯化工艺介绍

病毒纯化方法

1、离子交换层析法

常规病毒层析纯化方法主要采用离子交换。离子交换层析的优势是介质成本低,可以在捕获或者中纯阶段使用,能分离与杂质有不同离子强度的目标样品。病毒衣壳大多带负电荷,可以选择阴离子交换介质进行纯化。

2、凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析又叫分子筛,大多通过目的样品与杂质的分子量或形状差异来分离。混合样品过柱时,分子量大或者形状更大的物质会因为不能通过介质内部孔径而提前出峰,而分子量小或小颗粒物质会因为经过介质内部孔径,路径增加而出峰延迟达到分离的效果。

3、多模式层析法

多模式纯化采用离子交换、分子筛、疏水以及氢键等多种作用原理。多模式纯化是近些年来兴起的方法,此类介质可以结合不同纯化模式的优势,单次纯化获得较高纯度的病毒,提高纯化效率。

案例分享

案例:流感病毒纯化

根据上面介绍的病毒纯化工艺流程和相关层析介质,我们选择流感病毒样品对比凝胶过滤层析介质和多模式层析介质的纯化效果。

流感病毒样品经过超滤后,分别使用Smartarose 4FF和Smac Core 700过柱纯化,纯化后检测病毒回收率。

 

凝胶过滤层析
多模式层析

表1.Smac Core 700和Smartarose分别纯化病毒样品后回收率统计结果

纯化方法总结

*N/A:未测定

Smac Core 700的纯化效果与经典的Smartarose 4FF分子筛相近,但相同体积的介质,Smac Core 700的处理量要远高于Smartarose 4FF。

总结

病毒纯化三种层析模式各有特点(见下表),可以根据实际情况对纯化工艺进行适当调整以获得最合适且高效的层析条件。

粒子交换层析法

使用的相关纯化试剂: